H PCR και η Real Time RT-PCR Υπό Κριτική Ανασκόπηση

Σας ευχαριστώ θερμά για το ενδιαφέρον σας και την αναδημοσίευση των άρθρων μου. Θα εκτιμούσα ιδιαίτερα αν, κατά την κοινοποίηση, σ̲υ̲μ̲π̲ε̲ρ̲ι̲λ̲α̲μ̲β̲ά̲ν̲α̲τ̲ε̲ ̲κ̲α̲ι̲ ̲τ̲ο̲ν̲ ̲σ̲ύ̲ν̲δ̲ε̲σ̲μ̲ο̲ ̲(̲l̲i̲n̲k̲)̲ ̲τ̲ο̲υ̲ ̲ά̲ρ̲θ̲ρ̲ο̲υ̲ ̲μ̲ο̲υ̲. Αυτό όχι μόνο αναγνωρίζει την πηγή, αλλά επιτρέπει και σε άλλους να ανακαλύψουν περισσότερο περιεχόμενο. Η υποστήριξή σας είναι πολύτιμη για τη συνέχιση της δουλειάς μου.

---

Απόδοση στα ελληνικά: Απολλόδωρος - 8 Μαΐου 2022 | TAM |

---

Μπορείτε να κάνετε εφάπαξ ή επαναλαμβανόμενες δωρεές μέσω του Ko-Fi:

---

Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) περιγράφεται ως μέθοδος «ενίσχυσης» (αντιγραφής) συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA πολλές φορές χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο PCR και τεχνητά νουκλεοτίδια. Αρχικά αναπτύχθηκε για τη δημιουργία αρκετής ποσότητας θραυσμάτων DNA για ερευνητικούς σκοπούς, αλλά αργότερα έγινε εργαλείο για την εγκληματολογία, την αλληλουχία DNA και τη διάγνωση γενετικών ασθενειών.

Οι περισσότεροι από εμάς ακούσαμε για την PCR κατά τη διάρκεια της πανδημίας Covid-19 όπου η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Αντίστροφης Μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο (Real time RT-PCR) έγινε το χρυσό πρότυπο για την ανίχνευση του ιού Sars-Cov-2, ενός ιού που συνδέθηκε με τη νόσο Covid-19 .

Για την ανίχνευση Sars-Cov-2, επιλέχθηκαν συγκεκριμένες σύντομες αλληλουχίες του ιού. Όταν εκτελείται η RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, απελευθερώνεται σήμα βαφής φθορισμού εάν αυτές οι αλληλουχίες υπάρχουν στο δείγμα, αυτά τα σήματα καταγράφονται από ένα «Πραγματικού Χρόνου Σύστημα PCR- “Real-Time PCR System”».

Υπάρχουν πολλά άρθρα που επικρίνουν, ισχυριζόμενα ότι η PCR είναι ένα ακατάλληλο εργαλείο για τη διάγνωση της ιογενούς λοίμωξης, αλλά, στην πραγματικότητα, η ίδια η PCR δεν έχει εξεταστεί ποτέ κριτικά. Αυτό το άρθρο θα εξετάσει την PCR, την Real time RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, τα συστατικά και τον εξοπλισμό που χρησιμοποιούνται για την απόδοσή τους.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ:

ΟΡΟΛΟΓΙΑ

• ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

  • Σύντομο ιστορικό της PCR

  • Πώς λειτουργεί η PCR

  • Απομόνωση DNA

  • Συστατικά PCR

  • Βήματα PCR

  • Κριτική εξέταση της PCR

• REAL TIME RT-PCR (σε πραγματικό χρόνο)

  • Πώς χρησιμοποιείται η RT-PCR σε πραγματικό χρόνο για τη διάγνωση Sars-Cov-2

  • Συστατικά και εξοπλισμός RT-PCR σε πραγματικό χρόνο

  • Απομόνωση RNA

  • Βήματα RT-PCR σε πραγματικό χρόνο

  • Κριτική εξέταση πραγματικού χρόνου RT-PCR

• ΤΕΛΙΚΕΣ ΣΚΕΨΕΙΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

• ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ

  • Ερευνητικές εργασίες για την ενίσχυση του DNA

  • Ερευνητικές εργασίες των Kary Mullis et al που καθιερώνουν τη μέθοδο PCR

  • Άρθρα

  • Βίντεο

---

ΟΡΟΛΟΓΙΑ

Θα προσπαθήσω να περιορίσω τη χρήση επιστημονικών όρων, αλλά θα χρησιμοποιήσω μερικούς από τους παρακάτω όρους για να αποφύγω μεγάλες και περίπλοκες προτάσεις.

• Ενίσχυση DNA: τεχνητή αύξηση συγκεκριμένου θραύσματος/αλληλουχίας DNA

• PCR: Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, μια μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρέως για την ενίσχυση (αντιγραφή/πολλαπλασιασμό) συγκεκριμένης περιοχής/αλληλουχίας DNA

• RT-PCR: Αντίστροφη Μεταγραφή (RT) PCR, μέθοδος που χρησιμοποιείται όταν το δείγμα αποτελείται από RNA. Η RT είναι μια διαδικασία που μετατρέπει το RNA σε DNA παράγοντας έναν συμπληρωματικό κλώνο (cDNA) που θα ταιριάζει με τον κλώνο RNA

• Κύκλος PCR: ένας κύκλος PCR αποτελείται από τρία στάδια, μετουσίωση, ανόπτηση και επιμήκυνση. Κατά τη διάρκεια αυτών των βημάτων το DNA χωρίζεται και αντιγράφεται

• Νουκλεοβάση: συστατικό ζεύγους βάσεων, αδενίνη (Α), γουανίνη (G), θυμίνη (Τ), κυτοσίνη (C)

• Νουκλεοτίδιο: δομική μονάδα DNA/RNA, δηλαδή μία νουκλεοβάση και το πίσω οστό της

• Ολιγονουκλεοτίδια: βραχείς κλώνοι συνθετικών νουκλεοτιδίων

• dNTPs (τριφωσφορικά νουκλεοτίδια δεοξυριβόζης): συνθετικά νουκλεοτίδια

• Πολυμεράση: ένα ένζυμο που χρησιμοποιείται για την τεχνητή σύνθεση του DNA

• Εκκινητές DNA: σύντομοι κλώνοι συνθετικών νουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται από την πολυμεράση για την έναρξη της ενίσχυσης του DNA

• Ανιχνευτές: Ολιγονουκλεοτίδια βαμμένα με φθορίζουσα χρωστική

• Πρότυπο DNA/RNA: μονή αλυσίδα DNA ή RNA

• Καθίζημα/Πέλλετ: στερεά ύλη στον δοκιμαστικό σωλήνα

• Υπερκείμενο: υγρή ύλη στον δοκιμαστικό σωλήνα

• Πτύελα: σάλιο, φλέγμα και/ή βλέννα που αποβάλλεται από το άνω μέρος της αναπνευστικής οδού

• BALF: Βρογχοκυψελιδικό υγρό έκπλυσης που συλλέγεται από τους πνεύμονες

• Θερμικός κυκλοποιητής (γνωστός και ως thermocycler, μηχανή PCR, ενισχυτής DNA): μια μηχανή που χρησιμοποιείται για PCR

• Φυγοκέντρηση: έντονη περιστροφή που εκτελείται από μηχανή φυγοκέντρησης

ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

Σύντομο ιστορικό της PCR

Ο Kary Mullis πιστώθηκε με την εφεύρεση PCR για την οποία έλαβε το Νόμπελ Χημείας το 1993. Σύμφωνα με τον Mullis η ιδέα της PCR επινοήθηκε κατά την οδήγηση, και ο ίδιος πίστωσε τη χρήση ψυχαγωγικών ναρκωτικών, συγκεκριμένα το LSD, για την σύλληψη της διαδικασίας PCR. Οι K. Mullis, H. Erlich, RK Saiki και η ομάδα τους που εργάζονται στην Cetus Corporation έχουν αναπτύξει τη διαδικασία PCR. Η διαδικασία PCR κατοχυρώθηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας και αργότερα το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας πωλήθηκε στην Abbott Pharmaceuticals. Υπάρχουν αρκετές δικαστικές διαμάχες σχετικά με την PCR και το ένζυμο πολυμεράσης Taq, με αποτέλεσμα αυτά τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας να μην έχουν ανανεωθεί.

Σχέδιο της PCR από την Kary Mullis

Πώς λειτουργεί η PCR

Η τρέχουσα διαδικασία PCR είναι αρκετά απλή, δεν χρειάζεται καν να είστε μοριακός βιολόγος ή χημικός για να την εκτελέσετε, το μόνο που χρειάζεστε είναι ένα δείγμα που περιέχει DNA, πολλές χημικές ουσίες, συνθετικά συστατικά DNA και έναν θερμικό κυκλοποιητή, με όλα τα αναφερθέντα να πωλούνται αποκλειστικά από εταιρείες βιοτεχνολογίας όπως η Thermo Fisher και η Agilent Technologies. Το μόνο που έχετε να κάνετε είναι να εξαγάγετε DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ εξαγωγής DNA, να το αναμίξετε με τις χημικές ουσίες PCR, να το τοποθετήσετε στον θερμικό κυκλοποιητή, να ρυθμίσετε το πρόγραμμα (θερμοκρασίες και πόσους κύκλους να επαναλάβετε) και μετά από μία ή δύο ώρες θα έχετε περισσότερο DNA για εξέταση και εργασία.

Απομόνωση DNA

Απομόνωση/εξαγωγή DNA

Πριν από την εκτέλεση της PCR, το DNA πρέπει να εξαχθεί από την υπόλοιπη ύλη. Από την αρχική εξαγωγή DNA του Friedrich Miescher, δεν έχουν αλλάξει πολλά στη μεθοδολογία της εξαγωγής εκτός από την εισαγωγή ειδικού εξοπλισμού, θερμότητας και τεράστιου πλήθους κιτ εξαγωγής DNA στην αγορά. Κάθε κιτ και εξοπλισμός παρέχει τα δικά του πρωτόκολλα χρήσης.

Η εξαγωγή DNA (γνωστή και ως απομόνωση DNA, καθαρισμός DNA) αποτελείται από τέσσερα βήματα:

Κυτταρική «λύση» (δηλαδή διάσπαση του κυττάρου): η ουσία που περιέχει DNA αναμιγνύεται με συνθετικά ένζυμα, π.χ. RNase και πρωτεάση, καθώς και με ένα κοκτέιλ αλκαλοποιητικών και όξινων χημικών ουσιών που ονομάζεται «ρυθμιστικό». Το διάλυμα πιθανότατα θα στροβιλιστεί και στη συνέχεια θα επωαστεί σε θερμή έως υψηλή θερμοκρασία. Στη συνέχεια, το διάλυμα θα φυγοκεντρηθεί (περιστρέφεται έντονα) για να σπάσει η ύλη σε «υπερκείμενο» (το υγρό μέρος) και «σφαιρίδιο» (στερεή ύλη που θα βρίσκεται στον πυθμένα του σωλήνα). Ανάλογα με τα πρωτόκολλα του κιτ, το DNA θα βρίσκεται στο υπερκείμενο υγρό ή στην παλέτα, το μη απαραίτητο υλικό θα απορριφθεί και το διατηρούμενο υλικό μπορεί να αναμιχθεί με ρυθμιστικά διαλύματα και να φυγοκεντρηθεί λίγες επιπλέον φορές, το τελικό DNA θα βρίσκεται στο υπερκείμενο.

«Κατακρήμνιση» (του DNA από το διάλυμα): θα προστεθεί συνθετική αλκοόλη στην ουσία που ελήφθη από το προηγούμενο στάδιο, το νέο διάλυμα θα επωαστεί και θα φυγοκεντρηθεί. Αυτή τη φορά το DNA θα βρίσκεται στην παλέτα, το υπερκείμενο θα απορριφθεί και το DNA που έχει μείνει στο σωληνάριο θα αφεθεί για να στεγνώσει στον αέρα.

«Πλύσιμο» (του DNA): για την απομάκρυνση τυχόν υπολειμμάτων κυττάρων, θα προστεθεί χημική αλκοόλη (ξανά) και το διάλυμα θα φυγοκεντρηθεί άλλη μια φορά, το υπερκείμενο θα απορριφθεί και η παλέτα που λαμβάνεται θεωρείται ότι είναι το απομονωμένο DNA.

Επανααιώρηση (του DNA): το απομονωμένο DNA θα αναμιχθεί με ένα ρυθμιστικό διάλυμα ή νερό μοριακής ποιότητας, δηλαδή το απομονωμένο DNA θα εναιωρηθεί σε ένα χημικό διάλυμα, ρυθμιστικό διάλυμα ή εξαιρετικά καθαρό νερό, ανάλογα με το πόσο χρόνο θα χρειαστεί να παραμείνει το DNA αποθηκευμένο. Το ρυθμιστικό διάλυμα σταθεροποιεί το DNA και αποτρέπει την αποικοδόμησή του.

Συστατικά για την PCR

• Απομονωμένο DNA: Τις περισσότερες φορές θα εξαχθεί από κάποιο είδος σωματικού υγρού (αίμα, πτύελα ή BALF).

• Νερό

• Ρυθμιστικό διάλυμα PCR: Ένα τυπικό ρυθμιστικό διάλυμα περιέχει Tris-HCI (υδροχλωρικό τρις(υδροξυμεθυλ)αμινομεθάνιο) και KCl (χλωριούχο κάλιο). Αυτές οι χημικές ουσίες χρησιμοποιούνται για τη διατήρηση του pH του κοκτέιλ PCR σε σταθερή τιμή (μεταξύ 8,3-9 pH), η οποία παρέχει ένα σταθερό περιβάλλον για τη δραστηριότητα της DNA πολυμεράσης

• DNA πολυμεράση: ένα ένζυμο που συνθέτει κλώνους DNA. Η πιο γνωστή και χρησιμοποιούμενη είναι η πολυμεράση Taq

• MgCl 2 (χλωριούχο μαγνήσιο): ενισχύει τη δραστηριότητα της πολυμεράσης και ως αποτέλεσμα ενισχύει την ενίσχυση του DNA

• (NH4)2SO4 (θειϊκό αμμώνιο): παίζει τον ίδιο ρόλο με το MgCl 2

• Εκκινητές DNA (Primers): Οι εκκινητές είναι σύντομες, μονόκλωνες τεχνητές αλληλουχίες DNA που συνδέονται σε συγκεκριμένη περιοχή της μονής αλυσίδας του DNA. Υποδεικνύουν στην πολυμεράση το σημείο εκκίνησης της αλληλουχίας στην οποία οι επιστήμονες ενδιαφέρονται να αντιγράψουν. Οι επιστήμονες μπορούν να αγοράσουν προσχεδιασμένους εκκινητές ή μπορούν να ζητήσουν προσαρμοσμένες αλληλουχίες, και στις δύο περιπτώσεις μπορούν να αγοραστούν μόνο από εταιρείες βιοτεχνολογίας.

• dNTPs: είναι τεχνητά νουκλεοτίδια που χρησιμοποιούνται ως δομικά στοιχεία από την πολυμεράση για την ενίσχυση του DNA. Τα dNTP πωλούνται επίσης αποκλειστικά από εταιρείες βιοτεχνολογίας.

Τα αναφερόμενα συστατικά θα αναμειχθούν και θα τοποθετηθούν στη μηχανή θερμοκυκλωτή. Ο θερμοκυκλωτής θα εφαρμόσει συγκεκριμένες θερμοκρασίες για μια συγκεκριμένη χρονική διάρκεια αρκετές φορές («κύκλοι») για να ενισχύσει το DNA.

Βήματα PCR

Η διαδικασία PCR αποτελείται από τα ακόλουθα βήματα:

1. Εκκίνηση: Το μείγμα θερμαίνεται στους 94-96°C από 30 δευτερόλεπτα έως αρκετά λεπτά. Αυτό το βήμα ενεργοποιεί την DNA πολυμεράση και γίνεται μία φορά, στην αρχή της διαδικασίας PCR.

2. Μετουσίωση: Το μείγμα θερμαίνεται στους 94-98°C για 15-30 δευτερόλεπτα. Αυτό το βήμα θα «μετουσιώσει», δηλαδή θα χωρίσει το DNA σε δύο μονούς κλώνους.

3. Ανόπτηση: Στο στάδιο της ανόπτησης η θερμοκρασία θα πέσει στους 50-65°C για 20-40 δευτερόλεπτα, αυτή η θερμοκρασία επιτρέπει στους εκκινητές και στην πολυμεράση να συνδεθούν στην περιοχή που μας ενδιαφέρει να ενισχύσουμε. Συνήθως, η τέλεια θερμοκρασία είναι μερικούς βαθμούς χαμηλότερη από τη «θερμοκρασία τήξης» των ασταριών.

4. Επιμήκυνση/Επέκταση: Κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος η θερμοκρασία θα ανέλθει στους 72-80°C για 20-40 δευτερόλεπτα. Κατά τη διάρκεια αυτής της θερμοκρασίας, η πολυμεράση ενεργοποιείται και αρχίζει να συνδέει ελεύθερα επιπλέοντα dNTPs στον μονό κλώνο του DNA. Αυτό το βήμα έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία δύο νέων κομματιών διπλού κλώνου DNA. Η διάρκεια αυτού του βήματος εξαρτάται από το πόσο καιρό θέλουμε να είναι το αντίγραφο του DNA. Τυπικά, η DNA πολυμεράση μπορεί να αντιγράψει 1.000 ζεύγη βάσεων ανά λεπτό.

5. Τελική επιμήκυνση: Προαιρετικό αλλά συνιστώμενο βήμα όπου η θερμοκρασία διατηρείται στους 70-74°C για αρκετά λεπτά (συνήθως η ίδια θερμοκρασία όπως στο βήμα επιμήκυνσης). Αυτό το βήμα επιτρέπει στην πολυμεράση να ολοκληρώσει την αντιγραφή οποιουδήποτε κλώνου εργάζεται αυτήν τη στιγμή.

6. Τελικό κράτημα: μόλις ολοκληρωθεί το προκαθορισμένο πρόγραμμα, ο θερμοκυκλωτής αποθηκεύει το τελικό αποτέλεσμα σε θερμοκρασία που αποτρέπει την υποβάθμιση, 4-12°C.

Τα βήματα 2 έως 4 αντιπροσωπεύουν έναν κύκλο PCR και αυτός ο κύκλος επαναλαμβάνεται 15-40 φορές. Όσοι περισσότεροι κύκλοι εκτελούνται τόσο περισσότερα αντίγραφα DNA δημιουργούνται, αλλά μετά από συγκεκριμένο αριθμό κύκλων, π.χ. πάνω από 40, οι εκκινητές και τα νουκλεοτίδια μπορεί να εξαντληθούν προκαλώντας προβλήματα με το τελικό DNA στο σωληνάριο και επιπλέον πολλοί κύκλοι μειώνουν την αποτελεσματικότητα της PCR λόγω συσσώρευσης δημιουργούμενων υποπροϊόντων.

Κριτική εξέταση της PCR

• =#=#= DNA: Έχω ήδη συζητήσει την έννοια του DNA στο προηγούμενο άρθρο μου, το οποίο προτείνω ανεπιφύλακτα να το διαβάσετε καθώς θα βοηθήσει στην κατανόηση του τι μπορεί να είναι ή όχι το DNA. Για όσους θέλουν να προχωρήσουν με αυτό το άρθρο και να εξετάσουν το DNA σε μεταγενέστερο στάδιο, εδώ είναι μια γρήγορη περίληψη των κύριων ευρημάτων μου:

ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ, ΕΞΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΔΟΜΗ DNA - ΚΡΙΤΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ

• Στη διαδικασία απομόνωσης/εκχύλισης DNA, το θέμα που μας ενδιαφέρει αναμιγνύεται με χημικά και φυγοκεντρείται αρκετές φορές, στο τέλος θα εμφανιστεί ένα ίζημα στον σωλήνα που υποτίθεται ότι είναι DNA. Η προσωπική μου περιγραφή αυτής της διαδικασίας είναι μια «χημική πλύση νεκρού ιστού» και όχι απομόνωση ή εξαγωγή, επειδή μια σωστή απομόνωση ή εκχύλιση είναι όταν αφαιρούμε το ενδιαφέρον υλικό από την υπόλοιπη ύλη χωρίς χημικά, περιδίνηση ή θερμική επεξεργασία.

• Το εξαγόμενο DNA σπάνια, σχεδόν ποτέ, παρατηρείται στο μικροσκόπιο.

• Τα συστατικά των ζευγών βάσεων, αδενίνη (Α), κυτοσίνη (C), γουανίνη (G) και θυμίνη (Τ):

○ Είναι αόρατα, αλλά αυτά τα αόρατα συστατικά, υποτίθεται, είναι αυτά που χωρίζουν τον άνθρωπο από τα φυτά, τα δέντρα, τους βατράχους κ.λπ.

○ Η ποσότητα, η τοποθέτησή τους και η αντιστοίχιση υποβλήθηκαν με βάση τον «Κανόνα του Chargaff». Στην ερευνητική του εργασία, ο Erwin Chargaff απομόνωσε τα βασικά συστατικά του ζεύγους και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η ποσότητα του A είναι παρόμοια με το T και η ποσότητα του C είναι παρόμοια. Ο Chargaff δεν πρότεινε ποτέ τον μηχανισμό σύζευξης με βάση αυτές τις ποσότητες.

• Η μορφή διπλής έλικας προτείνεται με την εφαρμογή μαθηματικών μοντέλων σε ακτίνες Χ του DNA. Τα μαθηματικά είναι μια μορφή γλώσσας, ποσοτική, τα μαθηματικά δεν υπάρχουν στη φύση. Επιπλέον, η εφαρμογή μαθηματικών τύπων σε λίγες φωτογραφίες σχεδόν αόρατων αντικειμένων, μπορεί να πει πολύ λίγα για την πραγματική μορφή και δομή αυτού του αντικειμένου. Μόνο δύο φωτογραφίες ακτίνων Χ συγκεκριμένου DNA («άλας DNA» από θύμο μοσχαριού γνωστου και ως NaDNA) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί, μαθηματικά, η δομή και η μορφή του DNA, από τότε έχουμε μόνο λίγες φωτογραφίες DNA από άγνωστες πηγές και άγνωστης μεθοδολογίας εξαγωγής. Η μορφή του DNA βασίστηκε σε μεγάλο βαθμό στην υποθετική μοριακή δομή του DNA και η υποθετική μοριακή δομή βασίστηκε στην υποθετική μορφή.

• Ο ρόλος του DNA υποτίθεται, δεν έχουμε κανένα πραγματικό, τεκμηριωμένο στοιχείο που να δείχνει ότι το DNA αντιγράφεται, μεταγράφεται σε RNA και το RNA σε πρωτεΐνη. Όλες οι προτάσεις βασίζονται στην ποσοτική εξέταση ενός δείγματος πριν και μετά από ορισμένες διαδικασίες (χημικές πλύσεις, φυγοκέντρηση, θέρμανση και βρασμό). Το μικροσκόπιο χρησιμοποιείται σπάνια.

• Η DNA πολυμεράση περιγράφεται ως ένα ένζυμο που αντέχει και λειτουργεί σε υψηλές θερμοκρασίες. Ακολουθεί μια πολύ γρήγορη περίληψη των ερευνητικών εργασιών των Mullis et al, όπου πειραματίστηκαν με πολυμεράσες E. coli και Taq:

○ Ένα «απομονωμένο» (δηλ. χημικά επεξεργασμένο) E. coli ή Taq αναμειγνύεται με συστατικά που λαμβάνονται από εταιρείες biochtech (dNTPs, ρυθμιστικά διαλύματα κ.λπ.). Στην ερευνητική εργασία του E. coli, χρησιμοποίησαν ακόμη και αλάτι βαρίου, ρητίνη Dowex 50 και φθόριο.

○ Μετά τη φυγοκέντρηση, θέρμανση και ψύξη, η ποσότητα της συμμετοχής που λαμβάνεται μετράται με διάφορες τεχνικές κλασματικής κατακρήμνισης (έρευνα E. coli) και με ηλεκτροφόρηση γέλης (έρευνα Taq) για να προσδιοριστεί το «μοριακό μέγεθος/βάρος» του «DNA» στη συμμετοχή.

○ Δεν υπάρχει πραγματική παρατήρηση ενζυματικής δραστηριότητας και κάποιο DNA να μετατρέπεται σε περισσότερο DNA. Η τεκμηρίωση ορισμένων ποσοτήτων υποπροϊόντων μετά την ανάμειξη χημικών ουσιών με νεκρούς ιστούς ή βακτήρια δεν αποδεικνύει ότι υπάρχει ένα ένζυμο (πολυμεράση) που προσκολλάται στους εκκινητές και στον μοναδικό κλώνο του DNA (ssDNA) και με κάποιο τρόπο, ως δια μαγείας, συνδέει ελεύθερα επιπλέοντα dNTPs με το ssDNA στους 72-80°C.

○ Τα ένζυμα είναι γνωστά για την πέψη και την αποικοδόμηση της ύλης, όχι για τη σύνθεση.

○ Πειράματα ελέγχου χωρίς την πολυμεράση δεν πραγματοποιήθηκαν, ούτε χωρίς dNTPs ή άλλες χημικές ουσίες για να διαπιστωθεί η επίδραση κάθε συστατικού στο χημικό κοκτέιλ.

• Πραγματικά δεν γνωρίζουμε πώς συντίθενται τα τεχνητά νουκλεοτίδια (dNTP), τα ακριβή συστατικά και η μεθοδολογία δεν αποκαλύπτονται δημόσια και θεωρούνται εμπορικά μυστικά. Ο μόνος τρόπος για να τα αποκτήσετε είναι να τα αγοράσετε από εταιρείες βιοτεχνολογίας και να εμπιστευτείτε ότι λάβαμε ό,τι πληρώσαμε, καθώς δεν υπάρχει τρόπος επικύρωσης ή επιβεβαίωσης του περιεχομένου που λάβαμε. Κάτι πολύ ενδιαφέρον είναι ότι κατά την αγορά τους υπάρχει πάντα μια προειδοποίηση, «Μόνο για ερευνητική χρήση. Δεν προορίζονται για χρήση σε διαγνωστικές διαδικασίες» δηλ. εάν χρησιμοποιηθούν για διάγνωση, κανείς δεν μπορεί να κινήσει νομικά μέτρα κατά των εταιρειών βιοτεχνολογίας σε περίπτωση που υπάρχει πρόβλημα με το προϊόν. Αυτή η ρήτρα ισχύει σχεδόν για όλα τα συστατικά και τα εργαλεία που χρησιμοποιούνται για την PCR από όλες τις εταιρείες βιοτεχνολογίας.

• Οι εκκινητές (Primers) αγοράζονται επίσης από εταιρείες βιοτεχνολογίας. Η ανάπτυξη εκκινητών βασίζεται στον «κύκλο σύνθεσης» ολιγονουκλεοτιδίων, αυτή η διαδικασία περιέχει πολλά στάδια και χημικές ουσίες όπως ακετονιτρίλιο, 3% τριχλωροξικό οξύ σε διχλωρομεθάνιο, αργό, Ν-μεθυλιμιδαζόλη, πυριδίνη και ιώδιο. Είναι αρκετά άβολο το γεγονός ότι οι εκκινητές/ολιγονουκλεοτίδια χρειάζονται τόσα πολλά βήματα, χημικές ουσίες και διαλύτες για να συντεθούν και όλα αυτά χωρίς την παρατήρηση του μικροσκοπίου και κάποιου είδους πειραμάτων ελέγχου. Επειδή τα primers είναι αόρατα αυτό που θα λάβουμε στην πραγματικότητα είναι ένα άδειο μπουκάλι και ένα φύλλο διασφάλισης ποιότητας και όπως και με τα dNTP δεν μπορούμε να επικυρώσουμε ή να επιβεβαιώσουμε ότι στο μπουκάλι που λάβαμε έχουμε εκκινυητές και εάν υπάρχουν εκκινητές στο μπουκάλι ότι είναι οι ακολουθίες που έχουμε παραγγείλει.

• Γιατί τα Primers συνδέονται μόνα τους, αλλά τα dNTP χρειάζονται ένζυμο; Περιέχουν κάποιο είδος συστατικού «κόλλας»; Εάν συμβαίνει αυτό, γιατί να μην προσθέσετε αυτή την κόλλα στα dNTP (;) αυτό μπορεί να εξαλείψει την ανάγκη πολυμεράσης.

• Κατά τη διάρκεια της Μετουσίωσης το κοκτέιλ PCR θερμαίνεται στους 95°C. Η θερμότητα είναι πολύ επιβλαβής για τον ιστό, τα κύτταρα και το περιεχόμενο των κυττάρων. Ενώ η ακτινοβολία, μια μορφή θερμότητας, είναι επιστημονικά αποδεκτό ότι προκαλεί απόπτωση και βλάβη στο DNA, στην περίπτωση της PCR θεωρείται ότι η θερμοκρασία των 95°C χωρίζει το DNA σε δύο βάσεις. Γιατί η θερμότητα των 95°C χωρίζει το DNA σε δύο κλώνους και όχι σε διάφορα θραύσματα; π.χ. μονά ή διπλά θραύσματα; Δεδομένου ότι η μοριακή βιολογία δεν χρησιμοποιεί μικροσκόπιο και το DNA μελετάται εξαιρετικά σπάνια στο μικροσκόπιο, ποια στοιχεία έχουμε ότι το DNA χωρίζεται σε δύο κλώνους στην αναφερόμενη θερμοκρασία; Κάποιος μπορεί να υποστηρίξει ότι αυτός είναι ο λόγος που χρησιμοποιούνται αυτοί οι σταθεροποιητές (χημικές ουσίες), αλλά πώς ακριβώς μπορούν οι αλκαλικές/όξινες χημικές ουσίες να σταθεροποιήσουν κάτι στους 95°C; Οι θερμαινόμενες χημικές ουσίες μπορούν πραγματικά να προκαλέσουν μεγαλύτερη ζημιά στο υπό μελέτη θέμα.

• Στο στάδιο της Ανόπτησης, συνθετικοί εκκινητές χωρίς εγκέφαλο προσκολλώνται στους μεμονωμένους κλώνους DNA στους 60°C. Αυτό το βήμα δεν έχει κανένα νόημα, μόνο και μόνο επειδή αναμιγνύουμε νεκρό ιστό με συνθετικό ανάλογο (τεχνητά νουκλεοτίδια) που μπορεί να ταιριάζουν, δεν σημαίνει ότι προσκολλώνται, ειδικά σε ένα μείγμα όπου οι χημικές ουσίες αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του περιεχομένου. Για παράδειγμα, εάν τοποθετήσετε ένα μεγάλο και μικρό κομμάτι από το ίδιο ύφασμα και μερικά οξέα σε μια κατσαρόλα και τη ζεστάνετε στους 60°C, αυτά τα κομμάτια δεν θα δέσουν και δεν θα ξαναγίνουν ένα, κανένα κοτόπουλο κομμένο σε κομμάτια δεν θα συναρμολογηθεί κατά τη διάρκεια μαγειρέματος της σούπας. Ξέρω ότι οι συγκρίσεις ακούγονται κάπως αστείες, ίσως και ηλίθιες, αλλά δεν υπάρχουν πραγματικές αποδείξεις ότι τα primers συνδέονται με το DNA στους 60°C ή τα primers κάνουν οτιδήποτε. Εάν η θερμοκρασία ανόπτησης είναι η θερμοκρασία προσκόλλησης, τότε γιατί οι διαχωρισμένοι κλώνοι DNA δεν επανασυνδέονται μεταξύ τους αφού ταιριάζουν τέλεια; Συνθετικοί σύντομοι κλώνοι DNA συνδέονται, αλλά οι αρχικοί κλώνοι DNA όχι;

• Η θερμοκρασία της ανόπτησης πρέπει να είναι 5-7°C μικρότερη από το «σημείο τήξης» των εκκινητών. Το σημείο τήξης ορίζεται ως «η θερμοκρασία όπου το 50% του δίκλωνου DNA (dsDNA) χωρίζεται σε μονόκλωνο DNA (ssDNA)». Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι υπολογισμού της θερμοκρασίας ανόπτησης με κάθε μέθοδο να προτείνει διαφορετική θερμοκρασία. Αυτή η θερμοκρασία βασίζεται κυρίως στις νουκλεοβάσεις, συγκεκριμένα στην υποθετική μοριακή δομή και τη θερμοκρασία που «εκχωρείται» σε κάθε νουκλεοβάση. Το άρθρο: «Ένα φαινομενολογικό μοντέλο για την πρόβλεψη των θερμοκρασιών τήξης των αλληλουχιών DNA» παρέχει πληροφορίες σχετικά με τις πολλές υποθέσεις που γίνονται κατά την προσπάθεια υπολογισμού της θερμοκρασίας του σημείου τήξης των εκκινητών. Εάν η θερμοκρασία δεν είναι σωστή, οι εκκινητές, υποτίθεται, δεν θα κολλήσουν. Τώρα τίθεται ένα κρίσιμο ερώτημα: Ποια είναι η σχέση μεταξύ των δύο δεδομένων; (1) Οι εκκινητές συνδέονται σε θερμοκρασία όπου (2) το 50% του dsDNA μετατρέπεται σε ssDNA; Οι εκκινητές είναι ήδη μονόκλωνοι και το dsDNA έχει ήδη χωριστεί στο στάδιο της μετουσίωσης.

• Στους 75°C περίπου η πολυμεράση γίνεται ενεργή και «ενισχύει» το DNA. Σύμφωνα με την περιγραφή της PCR, η πολυμεράση αναγνωρίζει ένα από τα άκρα του εκκινητή και το επόμενο ζεύγος βάσεων του DNA που λείπει και, με κάποιο μαγικό τρόπο, μαζεύει τα αιωρούμενα γύρω από συνθετικά dNTP και τα τοποθετεί ανάλογα στον «κανόνα διαχωρισμού βάσης του Chargaff». Ο μόνος τρόπος με τον οποίο μπορώ να οραματιστώ αυτό το βήμα είναι να φανταστώ την πολυμεράση με τρία χέρια, το ένα κρατά τη μονή αλυσίδα του DNA, το άλλο τον εκκινητή και το τρίτο χέρι μαζεύει ελεύθερα αιωρούμενα συνθετικά νουκλεοτίδια, όχι μόνο αυτά που βρίσκονται κοντά, αλλά το σωστό που ταιριάζει με τον κανόνα του Chargaff. Η πολυμεράση γνωρίζει την κατεύθυνση της αντιγραφής του DNA (από 5' έως 3') γι' αυτό προσκολλάται στο δεξί άκρο του εκκινητή, ξέρει επίσης από πού πρέπει να ξεκινήσει η αντιγραφή, επειδή υπάρχει αυτός ο κανόνας για το πώς αντιγράφεται το DNA , από 5' έως 3' κατεύθυνση (άλλη μια μη-τεκμηριωμένη υπόθεση). Δεν κινείται προς τα πίσω, δηλαδή από 3' σε 5', και δεν προσκολλάται στο άλλο άκρο του εκκινητή, ξέρει, λειτουργεί με βάση καθιερωμένους κανόνες της μοριακής βιολογίας (που δεν έχουν παρατηρηθεί ποτέ στο μικροσκόπιο ή επικυρωθεί ). Η πραγματικότητα είναι ότι και πάλι δεν έχουμε αποδείξεις ότι κάτι τέτοιο συμβαίνει. Οι αρχικές ερευνητικές εργασίες που απομονώνουν και περιγράφουν το ρόλο και τη δράση της πολυμεράσης βασίζονται στην ύλη που υποβάλλεται σε χημική επεξεργασία, θερμαίνεται και στους όγκους των διαφορετικών προϊόντων πριν και μετά τη σύγκριση, τα συμπεράσματα βασίστηκαν στη στατιστική ανάλυση του υποπροϊόντος που δημιουργήθηκε μετά από αυτά τα βήματα, π.χ. υπάρχει αύξηση σε ραδιενέργεια ή φθορισμό στο τελικό αποτέλεσμα άρα αυτό σημαίνει ότι η πολυμεράση συνέθεσε περισσότερο DNA.

• Στο σενάριο όπου οι εκκινητές δεν συνδέονται, τότε η πολυμεράση δεν θα εκκινητές ; Αντιγράφει μόνο αν προσαρτηθούν εκκινητές ; Είναι τόσο έξυπνη; Τι θα συμβεί εάν η PCR γίνει χωρίς εκκινητές; Έκαναν τέτοιο πείραμα; και αν ναι ποιο είναι το τελικό αποτέλεσμα;

• Το Tris-HCI παράγεται από την αντίδραση ανάμειξης χημικών ουσιών, συγκεκριμένα συνθετικής αλκοόλης, πολυοξμεθυλενίου (πλαστικό με βάση τη φορμαλδεΰδη), νιτρομεθανίου (που παράγεται με συνδυασμό προπανίου και νιτρικού οξέος στην αέρια φάση στους 350–450°C) κ.λπ. Αυτό το μείγμα υποτίθεται ότι διατηρεί το pH του κοκτέιλ PCR σε σταθερή τιμή. Δεν γνωρίζω τίποτα ζωντανό που συνεχίζει να ζει (π.χ. DNA, ένζυμο πολυμεράσης) όταν εκχυλιστεί από την πηγή θρεπτικών συστατικών και τοποθετηθεί σε χημικό διάλυμα. Βάσει των συστατικών, το Tris-HCI μοιάζει περισσότερο με διάλυμα συντήρησης παρά με σταθεροποιητή, αν συμβαίνει αυτό, τότε πώς ακριβώς λειτουργεί η πολυμεράση (ένα ένζυμο που λαμβάνεται από βακτήρια E.coli ή Thermus aquaticus) σε τέτοιο (θερμασμένο) όξινο διάλυμα;

• Το MgCl 2 (χλωριούχο μαγνήσιο) είναι ένα ανόργανο άλας που αυξάνει την οξύτητα του μείγματος. Τίποτα ζωντανό, π.χ. πολυμεράση, δεν μπορεί πραγματικά να «ζήσει» ή να «λειτουργήσει» σε ένα τέτοιο χημικό περιβάλλον, ειδικά όταν θερμαίνεται.

• Το θειϊκό αμμώνιο είναι «δυνητικά επικίνδυνο για τους ανθρώπους και το περιβάλλον», αλλά είναι απολύτως καλό για την ενίσχυση του DNA.

• Ας εξετάσουμε το μηχάνημα θερμικού κυκλοποιητή (Thermal cycler) και τη λειτουργία του. Η θερμοκρασία μεταξύ κάθε σταδίου στον θερμικό κυκλοποιητή αλλάζει γρήγορα, κάθε βήμα του κύκλου διαρκεί λιγότερο από ένα λεπτό, πώς ακριβώς ψύχεται το χημικό κοκτέιλ από τους 95°C στους 60°C και στη συνέχεια μετά από λιγότερο από ένα λεπτό αυξάνεται ξανά γρήγορα σε 72°C-80°C; Ο θερμικός κυκλοποιητής λειτουργεί με ηλεκτρισμό, ας φανταστούμε ότι είναι ηλεκτρικός φούρνος, χρησιμοποιεί μεταλλικές πλάκες για να μεταφέρει τη θερμότητα. Ακόμα κι αν ο θερμικός κυκλοποιητής καταφέρει να ρυθμίσει τις θερμοκρασίες του αρκετά γρήγορα, το περιεχόμενο στους σωλήνες δείγματος θα απαιτήσει κάποιο επιπλέον χρόνο για να προσαρμοστεί και να πέσει ή να αυξηθεί στη θερμοκρασία που απαιτείται για κάθε συγκεκριμένο βήμα. Επειδή μιλάμε για δευτερόλεπτα, προσωπικά αμφιβάλλω ότι το περιεχόμενο στον δοκιμαστικό σωλήνα καταφέρνει να κατεβάσει θερμοκρασία για το στάδιο της ανόπτησης και μετά να ανεβάσει για το στάδιο της επιμήκυνσης. Επιπλέον, πόσο γρήγορα ένας ηλεκτρικός φούρνος ή η θερμική μεταλλική πλάκα μπορεί πραγματικά να αλλάξει τη θερμοκρασία του (;) ειδικά μειώνοντας τη θερμοκρασία σε δευτερόλεπτα; Εφαρμόζει κάποιου είδους μηχανισμό ψύξης; Είναι κάποιο είδος φούρνου και κατάψυξης σε ένα; Είναι δυνατόν να υπάρχουν αυτά τα δύο σε ένα (;) σε ένα τόσο μικρό κομμάτι μηχανής; Ας εξετάσουμε τον QIAamplifier 96 που υπόσχεται «Πρωτόκολλο γρήγορου κύκλου, έως και 45 λεπτά για 30 κύκλους» και ας χρησιμοποιήσουμε τον συντομότερο δυνατό κύκλο:

  • 45 λεπτά = 2.700 δευτερόλεπτα

  • 30 σύντομοι κύκλοι = 1.500 δευτερόλεπτα = (15 δευτερόλεπτα + 20 δευτερόλεπτα + 15 δευτερόλεπτα) x 30

  • Απομένουν 1.200 δευτερόλεπτα για τη ρύθμιση θερμοκρασιών, 1.200/30 κύκλοι = 40 δευτερόλεπτα για κάθε κύκλο

  • Κάθε κύκλος έχει 3 βήματα που σημαίνει 13,3 δευτερόλεπτα για κάθε μετάβαση, για κάθε αλλαγή θερμοκρασίας

  • Αμφιβάλλω σοβαρά ότι μπορεί να επιτευχθεί η απαραίτητη θερμοκρασία, ειδικά να πέσει μέσα σε 13,3 δευτερόλεπτα από τον θερμικό κυκλωτή και το περιεχόμενο στους σωλήνες δειγμάτων ή από οποιονδήποτε εξοπλισμό που λειτουργεί με θερμότητα.

• Τα αρχικά βήματα του κύκλου PCR πραγματοποιήθηκαν χειροκίνητα και τα συστατικά κάθε σταδίου προστέθηκαν πριν από κάθε βήμα του κύκλου. Τώρα όλα τα συστατικά προστίθενται εκ των προτέρων και όλα περνούν από όλες τις θερμοκρασίες κύκλου πολλές φορές. Απλά μια κριτική σκέψη, η θέρμανση αυτού του κοκτέιλ PCR δεν θα έχει εξευτελιστική επίδραση σε ορισμένα, αν όχι σε όλα, συστατικά; Σοβαρά, κάθε φορά κατά τη διάρκεια της μετουσίωσης, παίρνουμε δύο τέλεια μονόκλωνα DNA; Είναι δυνατόν να περιμένουμε να παραχθεί κάτι νέο σε αυτή τη ζεστή χημική σούπα;

• Δεν υπάρχει καμία απολύτως μικροσκοπική εξέταση του απομονωμένου DNA πριν και μετά τη χημική επεξεργασία, μετά από κάθε αλλαγή θερμοκρασίας και μετά από κάθε κύκλο PCR. Όλα θεωρούνται ότι γίνονται σωστά γιατί αν οι επιστήμονες κάνουν ηλεκτροφόρηση γέλης (θα καλυφθεί σε άλλο άρθρο) και υπάρχει έντονος φθορισμός, τότε αυτό σημαίνει ότι έχουν εξαγάγει υψηλή ποσότητα και ποιότητα DNA/RNA, ανεξάρτητα αν δεν ξέρουν σε τι έχουν καταλήξει στο σωλήνα καθώς (αναφέρθηκε πολλές, πολλές φορές ήδη) οι μοριακοί βιολόγοι δεν χρησιμοποιούν μικροσκόπιο. Κάποιος μπορεί να μου πει ότι οι επιστήμονες μπορούν να προσδιορίσουν την αλληλουχία του τελικού αποτελέσματος για να το επιβεβαιώσουν και να το μελετήσουν, αλλά τα μηχανήματα και τα συστατικά αλληλούχισης είναι αρκετά ακριβά, δεν μπορούν πολλά εργαστήρια να τα αντέξουν οικονομικά, ενώ τα συστατικά και η τεχνική αλληλούχισης είναι επίσης τόσο αμφισβητήσιμα όσο η απομόνωση DNA και η διαδικασία PCR.

• Όταν κάποιος ψάχνει για PCR, θα λάβει κινούμενες εικόνες και βίντεο για το τι συμβαίνει στα σωληνάρια δείγματος, αλλά η πραγματικότητα είναι ότι δεν υπάρχουν απολύτως έγκυρες και οπτικές αποδείξεις ότι κάθε βήμα συμβαίνει ως παρουσιάζουν τα κινούμενα σχέδια, π.χ. στους 95°C το DNA διασπάται , στους 60°C προσκολλώνται εκκινητές και στους 75°C το DNA «αντιγράφεται». Δεν γνωρίζουμε εάν το DNA διασπάται στους 95°C, δεν γνωρίζουμε αν προσκολλώνται εκκινητές και δεν γνωρίζουμε εάν η πολυμεράση προσκολλά dNTPs σε κλώνους DNA. Δεν υπάρχει καμία απολύτως ένδειξη ότι κάποιο βήμα έχει συμβεί όπως περιγράφεται.

• Τελευταίο, αλλά εξίσου σημαντικό, η ποσότητα των χημικών ουσιών που χρησιμοποιούνται, για την απομόνωση DNA και στη διαδικασία PCR, είναι ακατανόητη, ειδικά αν λάβουμε υπόψη ότι τα primers και τα dNTPs είναι επίσης χημικά, καθώς έχουν σχεδιαστεί τεχνητά με χρήση χημικών. Η ποσότητα κάποιου (νεκρού) ιστού που μας ενδιαφέρει είναι μικρότερη από το 1% του διαλύματος, ίσως και λιγότερο από το 0,1%. Για κάποιο λόγο πιστεύω ότι, απλά, η μελέτη του ιστού στο μικροσκόπιο χωρίς όλη τη χημική επεξεργασία και θέρμανση μπορεί να πει πολύ περισσότερα από όλα τα αναφερόμενα.

Real time RΤ-PCR σε πραγματικό χρόνο

Πώς χρησιμοποιείται η PCR για τη διάγνωση του Sars-Cov-2

Μια τροποποιημένη έκδοση της PCR, Real time Reverse-Transcription PCR (Real time RT-PCR), χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του Sars-Cov-2. Αυτή η μέθοδος ανίχνευσης ιών αναπτύχθηκε αρχικά από τους Victor M Corman, Christian Drosten et al. και αποτελείται από κάποια πρόσθετα συστατικά, εξοπλισμό και βήματα.

Τα πρόσθετα βήματα της RT-PCR σε πραγματικό χρόνο είναι:

• Ο Sars-Cov-2 δηλώνεται ως ιός RNA (μονόκλωνος), επειδή η τεχνική PCR αναπτύχθηκε με βάση και για το DNA (διπλός κλώνος), το RNA πρέπει να μετατραπεί σε DNA πριν από την εκτέλεση της PCR. Αυτό το βήμα, η μετατροπή του RNA σε DNA (με τη σύνθεση του συμπληρωματικού κλώνου του RNA) ονομάζεται Αντίστροφη Μεταγραφή (RT).

• Ο "πραγματικός χρόνος" εκτελείται από ένα σύστημα PCR που περιέχει Φθορόμετρο. Όταν οι επιστήμονες θέλουν να προσδιορίσουν εάν υπάρχει μια συγκεκριμένη αλληλουχία στο δείγμα, προσθέτουν βαμμένα με φθορισμό ολιγονουκλεοτίδια (γνωστά και ως ανιχνευτές). Εάν αυτοί οι ανιχνευτές προσκολληθούν στο εκμαγείο DNA/RNA, τότε θα εκπέμπεται ένα σήμα φθορισμού κατά τη διάρκεια του βήματος επιμήκυνσης. Αυτό το σήμα θα καταγραφεί από μια κάμερα και θα καταγραφεί από το λογισμικό PCR. Για την ανίχνευση Sars-Cov-2 χρησιμοποιούνται ειδικά σχεδιασμένοι εκκινητές και ανιχνευτές, αυτοί οι εκκινητές και ανιχνευτές βασίζονται σε σύντομες αλληλουχίες του γονιδιώματος Sars-Cov-2 που κοινοποιήθηκε στις Genbank και Gisaid..

Συστατικά και εξοπλισμός της Real time RT-PCR (σε Πραγματικό χρόνο)

• Απομονωμένο RNA

• Ρυθμιστικό διάλυμα και χημικές ουσίες (ίδια με την κανονική PCR): Tris-HCI, KCl, MgCl 2 και (NH4)2SO4

• Αντίστροφη μεταγραφάση (γνωστή και ως κατευθυνόμενη από RNA πολυμεράση DNA): ένα ένζυμο που μετατρέπει το RNA σε DNA. Συνθέτει τον συμπληρωματικό κλώνο του RNA (cDNA)

• Random Hexamer Primer: αυτοί οι εκκινητές χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση του cDNA

• Sars-Cov-2 Primers: ολιγονουκλεοτίδια βασισμένα στο γονιδίωμα Sars-Cov-2

• Ανιχνευτές DNA (γνωστοί και ως TaqMan) για Sars-Cov-2: Ολιγονουκλεοτίδια βασισμένα στο γονιδίωμα Sars-Cov-2 που περιέχουν χρωστική φθορισμού

• DNA πολυμεράση

• dNTPs (τεχνητά νουκλεοτίδια)

• Σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο: είναι σύστημα που συνδυάζει θερμικό κυκλοποιητή, φθορόμετρο και ειδικά σχεδιασμένο λογισμικό. Το σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο όχι μόνο αντιγράφει το DNA αλλά καταγράφει επίσης την απελευθέρωση φθοριζόμενων σημάτων εάν ενεργοποιηθούν οι βαμμένοι ανιχνευτές με φθορισμό.

Απομόνωση RNA

Όπως συμβαίνει με την τυπική PCR όπου το DNA πρέπει να απομονωθεί, πριν από την εκτέλεση RT-PCR το RNA πρέπει επίσης να απομονωθεί. Τα βήματα της απομόνωσης RNA του Sars-Cov-2 είναι αρκετά παρόμοια με την απομόνωση DNA. Ένα στυλεό με τα συλλεγμένα πτύελα τοποθετείται σε διάλυμα αντιδραστηρίου, το RNA θα εκχυλιστεί ως εξής:

• Λύση κυττάρων: Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης π.χ. αντιδραστήριο τριζόλης και χλωροφόρμιο αναμιγνύονται με το διάλυμα που περιέχει RNA. Το μείγμα θα ανακινηθεί ή θα στροβιλιστεί και θα φυγοκεντρηθεί. Η ανώτερη στιβάδα (υδατική στιβάδα), του διαλύματος, που περιέχει RNA, θα μεταφερθεί σε νέο σωλήνα.

• Καθίζηση: Συνθετική αλκοόλη (αιθανόλη, ισοπροπανόλη ή ισοπροπυλική αλκοόλη) θα προστεθεί στο διάλυμα RNA, το μείγμα θα φυγοκεντρηθεί και το υπερκείμενο (το υγρό μέρος του διαλύματος) θα απορριφθεί. Το RNA θα βρίσκεται στο σφαιρίδιο, αυτό το βήμα θα επαναληφθεί μία έως δύο φορές.

• Επανεναιώρηση/Έξυψη: Το λαμβανόμενο RNA θα επαναιωρηθεί σε νερό, συνθετική αλκοόλη ή σε ρυθμιστικό διάλυμα.

Βήματα της Real time RT-PCR (σε πραγματικό χρόνο)

• Το απομονωμένο RNA θα αναμιχθεί με ένζυμο ανάστροφης μεταγραφάσης (RT) και τεχνητά νουκλεοτίδια. Αυτό το ένζυμο θα συνθέσει τον συμπληρωματικό κλώνο του DNA (cDNA) που θα ταιριάζει με τον κλώνο RNA.

• Το στάδιο μετουσίωσης είναι το ίδιο όπως και με την τυπική PCR, θερμαίνοντας το μείγμα στους 95°C.

• Κατά τη διάρκεια του βήματος ανόπτησης, οι εκκινητές και οι ανιχνευτές sars-cov-2 θα συνδεθούν με τις μονές έλικες του DNA (ssDNA), οι εκκινητές και οι ανιχνευτές sars-cov-2 θα προσκολληθούν μόνο εάν το RNA/cDNA περιέχει αυτού του είδους τις σύντομες αλληλουχίες .

• Στο στάδιο της επέκτασης όπου η πολυμεράση συνθέτει τους νέους κλώνους, εάν η πολυμεράση φτάσει σε έναν προσαρτημένο ανιχνευτή, ο ανιχνευτής θα εκπέμψει ένα σήμα φθορισμού (φως) το οποίο θα συλληφθεί από μια κάμερα και θα καταγραφεί από ένα λογισμικό.

• Το λογισμικό θα καταγράφει τη σηματοδότηση των ανιχνευτών και την αύξησή τους με κάθε κύκλο.

Κριτική εξέταση της Real time RT-PCR (πραγματικού χρόνου)

Όλα τα κρίσιμα σημεία που εγείρονται κατά την εξέταση PCR σχετίζονται με την RT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Αλλά η RT-PCR σε πραγματικό χρόνο περιέχει πολλά πρόσθετα ζητήματα:

• Ενώ έχουμε λίγες φωτογραφίες του DNA με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (που δεν είναι τίποτα άλλο από μια στριμμένη αλυσίδα άγνωστης πηγής), έχουμε μηδενικές εικόνες και στοιχεία ύπαρξης RNA, της μορφής, της μοριακής δομής και της λειτουργίας του.

• Το διάλυμα αντιδραστηρίου που χρησιμοποιείται κατά τη συλλογή δείγματος που περιέχει RNA π.χ. αζίδιο του νατρίου, είναι μια εξαιρετικά τοξική χημική ουσία.

• Γιατί χρησιμοποιείται η αντίστροφη μεταγραφάση και όχι η πολυμεράση Taq για τη σύνθεση συμπληρωματικού κλώνου του RNA; Ποια είναι η ακριβής διαφορά μεταξύ των δύο ενζύμων;

• Η RT-PCR χρησιμοποιείται για το RNA. Στην RT-PCR το RNA «μεταγράφεται αντίστροφα» στο DNA (cDNA) χρησιμοποιώντας το ένζυμο αντίστροφης μεταγραφάσης. Αυτό βασίζεται στη θεωρία ότι το DNA μεταγράφεται σε RNA και το RNA μεταφράζεται σε πρωτεΐνες. Δεν έχουμε καμία πραγματική απόδειξη αυτής της θεωρίας, δηλαδή ότι αυτές οι διαδικασίες συμβαίνουν πραγματικά στα κύτταρά μας ή τεχνητά, βασικά ότι το σπάνια παρατηρούμενο στο μικροσκόπιο, ευαίσθητο DNA με κάποιο τρόπο (με τη βοήθεια ενός ενζύμου) παράγει ένα μονόκλωνο DNA (RNA) και ότι αυτό το μονόκλωνο παρέχει «οδηγίες» στα «ριβοσώματα» για το πώς να συνθέσουν πρωτεΐνες.

• Για κάποιο άγνωστο λόγο τα εργαστήρια που εκτελούν δοκιμές Sars-Cov-2 σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δεν αποκαλύπτουν τον αριθμό των κύκλων που πραγματοποιήθηκαν, το μόνο που παίρνουμε είναι ένα θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα συν τους εκκινητές και τους ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση της παρουσίας/ απουσία του ιού. Ο αριθμός των κύκλων είναι σημαντικός καθώς όσο υψηλότερος είναι ο αριθμός κύκλου τόσο μεγαλύτερη είναι η πιθανότητα ενός θετικού ή μη οριστικού αποτελέσματος. Δεν καταλαβαίνω γιατί μια τόσο σημαντική πληροφορία που επηρεάζει το αποτέλεσμα δεν αποκαλύπτεται, ειδικά από τη στιγμή που πληρώνουμε για αυτό το τεστ (απευθείας ή μέσω του Φόρων μας). Δεν είναι δικαίωμα μας να γνωρίζουμε, να ενημερωνόμαστε για όλες τις πτυχές για το πώς γίνονται αυτές οι εξετάσεις;

• Το τεστ Sars-Cov-2 RT-PCR που αναπτύχθηκε από τους Victor M Corman, Christian Drosten et al έχει πολλά προβλήματα με τα κύρια να είναι:

  • Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές σχεδιάστηκαν με βάση τις «αλληλουχίες ιών που σχετίζονται με το SARS διαθέσιμες στην GenBank έως την 1η Ιανουαρίου 2020», αυτό οφείλεται στο ότι δεν ήταν ακόμη διαθέσιμη η επίσημη κυκλοφορία του γονιδιώματος Sars-Cov-2. Βασικά, η RT-PCR σχεδιάστηκε με βάση ένα γονιδίωμα που δημιουργήθηκε από υπολογιστή.

  • Η ερευνητική εργασία υποβλήθηκε στις 21 Ιανουαρίου 2020 και αξιολογήθηκε από ομοτίμους και δημοσιεύτηκε μέσα σε λιγότερο από 24 ώρες (δεν έχει συμβεί ποτέ πριν). η αξιολόγηση από ομοτίμους δεν έχει δημοσιοποιηθεί.

  • Ο Drosten τυγχάνει να είναι συντάκτης του περιοδικού στο οποίο δημοσιεύτηκε η εργασία τους (eurosurveillance).

  • Η TIB Molbiol, μια γερμανική εταιρεία βιοτεχνολογίας, ανέπτυξε το κιτ Sars-Cov-2 RT-PCR με βάση τα πρωτόκολλα Corman-Drosten και άρχισε να τα στέλνει ήδη από τις 10 Ιανουαρίου 2020, πριν από την επίσημη ανακοίνωση ενός ιού από τον ΠΟΥ και της επίσημης δημοσίευσης της ακολουθίας.

  • Επιπλέον, κυκλοφόρησαν αρκετές αλληλουχίες γονιδιώματος από επιστήμονες στο GISAID, τη GENBANK και το Virological.org μεταξύ 10ης και 11ης Ιανουαρίου, δεν είναι πολύ γνωστό πώς δημιουργήθηκαν αυτά τα γονιδιώματα, π.

  • Δύο από τους συγγραφείς των ερευνητικών εργασιών RT-PCR είναι ο Olfert Landt, ιδρυτής της TIB Molbiol και ο Marco Kaiser, επιστημονικός σύμβουλος της Tib-Molbiol.

  • Η ποσότητα των χημικών ουσιών και των διαδικασιών στην RT-PCR σχεδόν διπλασιάζεται σε σύγκριση με την PCR, γεγονός που κάνει κάποιον να αναρωτιέται τι ακριβώς καταλήγει στον δοκιμαστικό σωλήνα εκτός από ένα μικροσκοπικό κομμάτι σωματικού υγρού που αιωρείται σε ζεστή χημική σούπα.

ΤΕΛΙΚΕΣ ΣΚΕΨΕΙΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

Όπως και με την εξαγωγή και τη λειτουργία του DNA, δεν είμαι πεπεισμένος ότι αυτό που ισχυρίζεται συμβαίνει στην πραγματικότητα κατά τη διάρκεια της PCR. Δεν υπάρχει εμπλοκή μικροσκοπίου, δεν γίνονται πειράματα ελέγχου, υπάρχουν αυτός ο αμφίβολος εξοπλισμός και τα χημικά και άπειρα βήματα και θερμότητα.

Αυτό που βλέπω προσωπικά είναι ένας αδικαιολόγητος και αναπόδεικτος ισχυρισμός ότι μια μικρή ποσότητα νεκρής ή εκφυλισμένης ύλης (οτιδήποτε εξάγεται από την πηγή θρεπτικών συστατικών είναι νεκρό ή σε διαδικασία αποσύνθεσης) όταν αναμειγνύεται με πολλές χημικές ουσίες οξίνισης και εμπορικά μυστικά «συστατικά» και θερμαίνεται για μεγάλο χρονικό διάστημα, «θα δημιουργήσει πολλά αντίγραφα του «DNA» ».

Πώς ακριβώς συνθέτει ύλη ένα βακτηριακό ένζυμο, που απομονώνεται από θερμικές πηγές; Τα βακτήρια αφομοιώνουν, ζυμώνουν και αποσυνθέτουν την ύλη, είναι φυσικοί ανακυκλωτές. Αυτό το βακτηριακό ένζυμο (Taq ή πολυμεράση E.coli) απομονώθηκε χρησιμοποιώντας τόνους χημικών ουσιών και θερμότητας, πώς ακριβώς λειτουργεί ένα βακτηριακό ένζυμο χωρίς τα βακτήρια που το παράγουν; Και πώς ακριβώς προσάρτησε συνθετικά νουκλεοτίδια στο συνθετικό sdDNA;

Η πραγματικότητα φαίνεται αρκετά απλή, όταν εφαρμόζεται η κοινή λογική, όταν χρησιμοποιούμε τόνους χημικών, θερμότητα και φυγοκέντρηση, το μόνο που θα πάρουμε είναι μια τοξική σούπα που περιέχει 0,0000001% νεκρή ύλη (αν πιστεύουμε ότι η PCR πολλαπλασιάζει κάτι τότε μπορεί να δημιουργήσει 1.073.741.824 αντίγραφα μόνο από ένα DNA σε 30 κύκλους). Αν χρειαζόταν να συγκρίνω τις διαδικασίες PCR ή πραγματικού χρόνου RT-PCR με κάτι, θα ήταν το ζέσταμα ενός γεύματος σε φούρνο μικροκυμάτων ή σε φούρνο. Φανταστείτε να τοποθετείτε στον φούρνο για μισή ώρα μια μικρή ποσότητα κρέατος με άφθονα χημικά και κάποια συνθετική ύλη που διαφημίζεται ότι μετατρέπεται σε συνθετικό κρέας. Αυτή η διαδικασία θα δημιουργήσει περισσότερο κρέας (;) που μπορεί να καταναλωθεί; Ή θα καταλήξουμε με ένα άκρως τοξικό και μη φαγώσιμο μείγμα, μπορεί ακόμη και να είναι επικίνδυνο για τον φούρνο και το περιβάλλον.

Μια άλλη αναλογία θα ήταν η ανάμειξη κομματιών lego με ένα χημικό κοκτέιλ, η τοποθέτηση του μείγματος στο φούρνο και η αναμονή συναρμολογημένων legos μετά από μια ώρα στους 95°C. Δεν θα υποβαθμίζονταν ή δεν θα έλιωναν; Δεν θα υποβαθμίζονταν τα πάντα σε θερμοκρασία PCR;

Στην πραγματικότητα τίποτα νέο δεν σχηματίζεται σε υψηλές θερμοκρασίες, είτε κατά το βράσιμο είτε κατά τη θέρμανση κ.λπ. Η ύλη απλώς οξινίζεται και τα συστατικά αλλοιώνονται. Ο ισχυρισμός ότι η DNA πολυμεράση συνθέτει κάτι μπορεί στην πραγματικότητα να είναι υποπροϊόν της οξίνισης και της αποικοδόμησης των συστατικών κατά τη θερμική επεξεργασία.

Αισθάνομαι ότι δεν χρειάζεται να μπω σε μεγάλο βάθος και στο ιστορικό της PCR. Κάποιος που διαβάζει αυτές τις εργασίες και χρησιμοποιώντας κάποια βασική λογική θα καταλάβει ότι δεν υπάρχει καμία απολύτως απόδειξη ότι η DNA πολυμεράση προσκολλάται σε οτιδήποτε ή συνθέτει οτιδήποτε, επειδή οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται, η μεθοδολογία εκχύλισης και τα συμπεράσματα βασίζονται σε όγκους υγρού πριν και μετά τη χημική επεξεργασία , θέρμανση και φυγοκέντρηση. Και πάλι καμία απολύτως εμπλοκή μικροσκοπίου.

Εάν αφαιρέσουμε όλα τα βιοχημικά προϊόντα και τον πιο πρόσφατο βιοτεχνολογικό εξοπλισμό, θα μπορέσουν οι μοριακοί βιολόγοι να πραγματοποιήσουν οποιοδήποτε από τα πειράματά τους; Είναι προφανές ότι οι μοριακοί βιολόγοι βασίζονται σε μεγάλο βαθμό σε εταιρείες βιοτεχνολογίας, δεν είναι σε θέση να δημιουργήσουν τα δικά τους υλικά/απόθεμα και δεν είναι σε θέση να επικυρώσουν την ακρίβεια των προϊόντων και την αποτελεσματικότητα του εξοπλισμού. Αυτά τα γεγονότα με κάνουν να αμφισβητήσω τη δύναμη και τον έλεγχο που έχουν αποκτήσει οι εταιρείες βιοτεχνολογίας τις τελευταίες δεκαετίες στον τομέα της επιστήμης.

Όπως και με την εξαγωγή DNA, η PCR δεν είναι τίποτα περισσότερο από ένα κοκτέιλ χημικής ουσίας που θερμαίνεται για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Μας ζητείται να μην αμφισβητήσουμε τις ανακαλύψεις και τις διαδικασίες της επιστήμης ή της μοριακής βιολογίας, που είναι «καθιερωμένες», βραβευμένες με Νόμπελ, απλώς εμπιστευθείτε τις κινούμενες εικόνες και τα βίντεο που μας παρέχονται για να εξηγήσετε τι συμβαίνει στο σωληνάριο δείγματος. Το λένε επιστήμη. Προσωπικά θα το έλεγα λατρεία. Μια λατρεία που ανέπτυξε τόνους περιττών όρων και διαδικασιών που καθιστούν την «επιστήμη» τους ανέφικτη από έναν απλό άνθρωπο, με αποτέλεσμα να κάνει τους ανθρώπους πιο επιρρεπείς στο να «εμπιστεύονται και να ακολουθούν» τους επιστήμονες. Εάν ένα άτομο αφαιρέσει το φράγμα της ορολογίας και κοιτάξει τα συστατικά και τις διαδικασίες ως έχουν, θα συνειδητοποιήσει ότι η βιοχημεία ή η μοριακή βιολογία δεν είναι τίποτα άλλο παρά η μέτρηση των υποπροϊόντων που παράγονται από χημικές αντιδράσεις και θερμότητα, υποπροϊόντα που μπορούν να πουν πολύ λίγα για τη ζωή και κυρίως για την υγεία.

Κάποιος θα μπορούσε να ρωτήσει, λοιπόν, τι καθιστά το Sars-cov-2 RT-PCR «θετικό»; Οφείλω να ομολογήσω ότι δεν ξέρω. Αυτό που ξέρω είναι ότι ο Covid-19 (η ασθένεια που υποτίθεται ότι συνδέεται με τον ιό Sars-Cov-2) δεν περιέχει νέα ή ασυνήθιστα συμπτώματα προκειμένου να χαρακτηριστεί ως νέα/νέα ασθένεια. Το Covid-19 περιέχει όλα τα γνωστά συμπτώματα σχεδόν όλων των κοινών ασθενειών. από τα συμπτώματα του κοινού κρυολογήματος και της γρίπης μέχρι την πνευμονία και τη γαστρεντερίτιδα, τον τελευταίο καιρό η πήξη του αίματος, οι πονοκεφάλοι και ακόμη και η κατάθλιψη προστίθενται στον πολύ μακρύ κατάλογο των συμπτωμάτων του Covid-19. Κάποιος που θα είναι θετικός θα υποβληθεί σε θεραπεία με βάση τα πρωτόκολλα Covid-19 που αποτελούνται από ένα πειραματικό μείγμα φαρμάκων και ακόμη και αναπνευστήρα. Κάποιος με συμπτώματα που βγαίνει αρνητικός θα αντιμετωπίζεται με τον παλιό τρόπο, π.χ. θεραπεία ή/και φάρμακα θα συνταγογραφούνται με βάση τα συμπτώματα. Επιπλέον, η PR-PCR σε πραγματικό χρόνο μας εισήγαγε σε μια νέα ιδέα, την έννοια του να είσαι ασυμπτωματικός φορέας ενός ιού που μπορεί να προκαλέσει θάνατο σε κάποιον άλλο. Είναι μια ενδιαφέρουσα ιδέα, καθώς είναι φορέας ενός θανατηφόρου ιού που δεν προκαλεί συμπτώματα στον ξενιστή, αλλά μπορεί να σκοτώσει κάποιον άλλο όταν μεταδοθεί. Φανταστείτε εάν αυτή η έννοια εισήχθη για την κοινή γρίπη, κανένας κανονικός άνθρωπος δεν θα το πίστευε και θα μπορούσε να αρχίσει να αμφισβητεί την ιατρική/μοριακή επιστήμη. Και πώς ακριβώς μεταδίδεται αυτός ο ιός; Πώς αποδεικνύεται ότι ακόμα κι αν κάτι μεταδοθεί προκαλεί συμπτώματα; Προκαλεί συμπτώματα σε ένα άτομο αλλά κανένα σύμπτωμα σε άλλο; Εάν εντοπιστεί σε ένα υγιές άτομο και σε ένα άρρωστο άτομο, τότε ίσως δεν είναι η αιτία της νόσου; Ικανοποιήθηκαν τα αξιώματα του Koch από το Sars-Cov-2 (;) από κάποιον ιό; Η απομόνωση του ιού είναι εξίσου αφύσικη και ενοχλητική διαδικασία με τις απομονώσεις DNA και RNA που περιέχουν πολλές χημικές ουσίες και στάδια (η απομόνωση του ιού και το κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα θα συζητηθούν σε μελλοντική ανάρτηση).

Αυτό που με εκπλήσσει είναι ότι οι επιστήμονες έφτασαν στο στάδιο της ενίσχυσης του συνθετικού DNA. Τι ακριβώς θα κερδίσουν από την αντιγραφή και τη μελέτη συνθετικού DNA ή RNA; Ακόμα κι αν αυτές οι αλληλουχίες δημιουργούνται με βάση κάποιο ανθρώπινο ή ιϊκό (που δημιουργείται από υπολογιστή) γονιδίωμα, τι ακριβώς μπορούν να πουν οι συνθετικές αλληλουχίες για ανθρώπους, ζώα, ασθένειες, βακτήρια, ιούς, τη ζωή γενικά; Φανταστείτε αν οι επιστήμονες και η ιατρική βιομηχανία φτάσουν στο στάδιο να ανακοινώσουν ανακαλύψεις και να δημιουργήσουν διαγνωστικά τεστ, εργαλεία και εξοπλισμό με βάση αυτές τις τεχνητές, εντελώς εξωπραγματικές «ακολουθίες».

Το εκπληκτικό είναι ότι οι επιστήμονες προσπαθούν ακόμη και να δημιουργήσουν συνθετικά κύτταρα και οργανισμούς με βάση το DNA [αλληλουχίες] χρησιμοποιώντας PCR, αν και έχουν μικρή έως καθόλου επιτυχία, δικαιολογούν την αποτυχία επιρρίπτωντας την ευθύνη στην τεχνολογία, συγκεκριμένα, στους περιορισμούς της διαδικασίας και του εξοπλισμού PCR. Η επιστημονική αυταπάτη έφτασε σε τέτοιο στάδιο που προτείνουν την PCR να γίνει «μέθοδος κυτταρικής αντιγραφής» την οποία ονόμασαν «Αντίδραση κύκλου αντιγραφής (RCR) όπου «…αυτή η μέθοδος αναμένεται να είναι ένα σύστημα πλατφόρμας για την κατασκευή τεχνητών κυττάρων με ικανότητα αντιγραφής μεγάλου DNA. Λαμβάνοντας υπόψη ότι το RCR είναι ένα ανασυσταμένο σύστημα αντιγραφής γονιδιώματος από Ε. coli, το σύστημα θα μπορούσε να εφαρμοστεί για να αποσαφηνίσει τον μηχανισμό αντιγραφής γονιδιώματος και διαίρεσης μικροοργανισμών. Ωστόσο, παραμένουν αρκετές τεχνικές προκλήσεις…» Αν πιστεύουν στη δυνατότητα δημιουργίας συνθετικής ζωής, τότε πρέπει να πιστέψουν ότι δεν είμαστε τίποτα άλλο απο ένα κομμάτι κρέας που είναι ζωντανό και λειτουργεί λόγω χημικών αντιδράσεων. Είναι οι σκέψεις, οι παρατηρήσεις και τα συναισθήματά μου προϊόντα χημικών αντιδράσεων; Δεν υπάρχει καμία ανάμειξη κάποιου είδους μορφής συνείδησης; Τι γίνεται λοιπόν με όλες αυτές τις ιστορίες εξωσωματικής εμπειρίας και επίσης κοντά στις εμπειρίες θανάτου; Ψευδαισθήσεις; Η αίσθηση ότι είμαστε πολύ περισσότερα από ένα φυσικό σώμα είναι αυταπάτη;

Σε αυτό το σημείο, με όλη την «καθιερωμένη» επιστήμη που επηρεάζει τις ζωές μας σε καθημερινή βάση, ειδικά τα τελευταία δύο χρόνια, το «σκέψου μόνος σου» είναι το καλύτερο και πιο σημαντικό εργαλείο που διαθέτουμε για να αντιμετωπίσουμε τα κυβερνητικά μέτρα του Covid-19, την κύρια επιστήμη , ιατρική, εκπαίδευση και υγεία.

Ειλικρινά,

Tam

ΥΓ: κάτι που με εξέπληξε δεν είναι μόνο η ποσότητα των χημικών που χρησιμοποιήθηκαν αλλά και η ποσότητα πλαστικού μίας χρήσης π.χ. σωλήνες δειγμάτων, μύτες πιπέτας, γάντια, συνθετική αλκοόλη κ.λπ. Μοιάζει με αρκετά ρυπογόνο επιστήμη, σε χημικά και πλαστικά επίπεδα.

ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ

Ερευνητικές εργασίες για την ενίσχυση του DNA:

• 1967, Enzymatic Synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of Infectious Phage φ X174 DNA

• 1971, Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases DOI: 10.1016/0022-2836(71)90469-4

• 1976 Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus PMC232952  

Ερευνητική εργασία των Kary Mullis et al που καθιερώνει τη μέθοδο PCR:

• 1982, Winkler ME, Mullis K, Barnett J, Stroynowski I, Yanofsky C. Ο τερματισμός της μεταγραφής στον εξασθενητή οπερονίου τρυπτοφάνης μειώνεται in vitro από ένα ολιγομερές συμπληρωματικό σε ένα τμήμα της μεταγραφής οδηγού https://www.pnas.org/content /79/7/2181

• 1985, Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich ΗΑ, Arnheim Ν. Ενζυματική ενίσχυση γονιδιωματικών αλληλουχιών βήτα-σφαιρίνης και ανάλυση θέσεων περιορισμού για διάγνωση δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Science (Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη). 230: 1350-4. PMID 2999980 DOI: 10.1126/Science.2999980 

• 1986, Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain αντίδραση. Cold Spring Harbor Symposia On Quantitative Biology . 51: 263-73. PMID 3472723 DOI: 10.1101/Sqb.1986.051.01.032 

• 1986, Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Ανάλυση ενζυματικά ενισχυμένης βήτα-σφαιρίνης και HLA-DQ άλφα DNA με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές ειδικούς για αλληλόμορφα. Φύση . 324: 163-6. PMID 3785382 DOI: 10.1038/324163A0 

• 1987, Mullis KB, Faloona FA. [21] Ειδική σύνθεση DNA in vitro μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης καταλυόμενης από πολυμεράση Methods in Enzymology . 155: 335-350. DOI: 10.1016/0076-6879(87)55023-6 

Άρθρα:

Η ιστορία της PCR

Αξιολόγηση απόδοσης θερμικών ανακυκλωτών για PCR σε συνθήκες ταχείας κύκλου

PCR – Μια κριτική εξέταση

PCR Cycling Parameters–Έξι βασικά ζητήματα για την επιτυχία

Τι είναι η PCR; – Ο οδηγός για αρχάριους

ΕΚΘΕΣΗ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗΣ CORMAN-DROSTEN ΑΠΟ ΜΙΑ ΔΙΕΘΝΗ ΚΟΙΝΟΠΡΑΞΙΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ ΣΤΙΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΖΩΗΣ (ICSLS)

Τα πολλά σκάνδαλα του τεστ PCR: Μέρος 1

Τα πολλά σκάνδαλα του τεστ PCR: Μέρος 2

Βίντεο:

• What is PCR? Polymerase Chain Reaction | miniPCR bio™

• Coronavirus Test: Real time RT-PCR – Animation video

• RT-PCR for diagnosing COVID-19 (former 2019-nCoV)

Αν σας άρεσε αυτό το άρθρο, μοιραστείτε το με την οικογένεια, τους φίλους και τους συναδέλφους σας, εγγραφείτε για να λαμβάνετε περισσότερο περιεχόμενο και αν θέλετε να στηρίξετε το συνεχές έργο μου, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε τον παρακάτω σύνδεσμο.

Παρακαλώ βοηθήστε να στηρίξετε το έργο μου. 🙏

---

---Δικτυογραφία :

PCR and Real Time RT-PCR under critical review – Critical Check

https://criticalcheck.wordpress.com/2022/05/08/pcr-and-real-time-rt-pcr-under-critical-review/