ΦΑΚΕΛΛΟΣ ΙΟΛΟΓΙΑ: Αλήθεια, Υπάρχει Τέτοιο Πράγμα όπως “Ειδικότητα Αντισώματος”; (Antibody Specificity?)
Μετάφραση: Απολλόδωρος
12 Νοεμβρίου 2022 | ViroLIEgy | Διαβάστε το εδώ
"Όχι, δεν υπάρχει κάτι τέτοιο όπως ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που, επειδή είναι μονοκλωνικό, αναγνωρίζει μόνο μία πρωτεΐνη ή μόνο έναν ιό. Θα συνδεθεί με οποιαδήποτε πρωτεΐνη που έχει την ίδια (ή μια πολύ παρόμοια) αλληλουχία".
-Clifford Saper, μία από τις κορυφαίες αυθεντίες στον κόσμο για τα μονοκλωνικά αντισώματα, καθηγητής της Ιατρικής Σχολής του Harvard
https://off-guardian.org/2021/03/06/the-antibody-deception/
Ένα από τα κύρια σημεία πώλησης για τη χρήση των αντισωμάτων είναι η υποτιθέμενη ("εικαζόμενη") εξειδίκευσή τους. Πρόκειται για την ικανότητα του αντισώματος να διακρίνει μεταξύ παρόμοιων ή και ανόμοιων αντιγόνων. Με αυτόν τον τρόπο οι ερευνητές προσπαθούν να ισχυριστούν ότι η μέτρηση ενός "ειδικού" αντισώματος σημαίνει ότι κάποιος έχει εκτεθεί σε έναν συγκεκριμένο "ιό" στο παρελθόν ή ότι είναι σήμερα "άνοσος" μετά από εμβολιασμό. Αυτές οι μετρήσεις χρησιμοποιούνται προκειμένου να δηλώσουν ότι ο εμβολιασμός είναι επιτυχής εάν δουν αύξηση ενός "ειδικού" αντισώματος σε ένα καθορισμένο (και φαινομενικά αυθαίρετο) ποσό τίτλων.
Ωστόσο, είναι γνωστό εδώ και δεκαετίες ότι τα αντισώματα δεν είναι στην πραγματικότητα τόσο συγκεκριμένα όσο ισχυρίζονται ότι είναι. Πολυάριθμες επιστημονικές εργασίες έχουν αποσυρθεί λόγω μη αναπαραγώγιμων και μη αναπαραγώγιμων αποτελεσμάτων που προέκυψαν από υποσχόμενη εξειδίκευση αντισωμάτων που δεν ήταν δυνατόν να υπάρξει. Αντί να προσδένονται στον επιθυμητό στόχο, τα αντισώματα αυτά λέγεται ότι προσδένονται τακτικά σε παρόμοιους ή ακόμη και σε εντελώς άσχετους στόχους. Συχνά διασταυρώνονται με άλλους "ιούς" ή αποτυγχάνουν να εμφανιστούν σε αξιοσημείωτες ποσότητες σε άτομα που έχουν προφανώς εκτεθεί. Αυτή η έλλειψη εξειδίκευσης είναι ένας από τους πολλούς λόγους για τους οποίους η έρευνα των αντισωμάτων αντιμετωπίζει μια καταστροφική κρίση αναπαραγωγιμότητας, η οποία χειροτερεύει όσο περνάει ο καιρός.
Ένας από τους ανθρώπους που προσπαθούν να καθαρίσουν αυτό το ανυπέρβλητο χάος είναι ο ειδικός στα αντισώματα Clifford Saper. Ήταν αρχισυντάκτης του περιοδικού Journal of Comparative Neurology μεταξύ 1994 και 2011. Στο διάστημα αυτό, ο Saper ήρθε αντιμέτωπος με πολυάριθμες ερευνητικές εργασίες που έπρεπε να αποσυρθούν λόγω λανθασμένων αποτελεσμάτων από ελαττωματικά αντισώματα. Αποσπάσματα από το παρακάτω άρθρο του Nature από το 2015 παρέχουν περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τη συμμετοχή του Saper σε μια προσπάθεια να διορθωθεί αυτό το χάος και τα συνεχιζόμενα προβλήματα που αντιμετωπίζει η έρευνα αντισωμάτων:
Αναρχία των Αντισωμάτων: Μια Έκκληση για Τάξη
Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην έρευνα δίνουν συχνά συγκεχυμένα αποτελέσματα. Η ευρύτερη ευαισθητοποίηση και οι προηγμένες τεχνολογίες υπόσχονται σαφήνεια.
"Ένα ποντίκι ειδοποίησε για πρώτη φορά τον Clifford Saper για το γεγονός ότι τα αντισώματα παραπλανούσαν την επιστημονική κοινότητα. Ως αρχισυντάκτης του περιοδικού Journal of Comparative Neurology μεταξύ 1994 και 2011, χειρίστηκε δεκάδες εργασίες στις οποίες οι επιστήμονες βασίζονταν σε αντισώματα για να επισημάνουν τις θέσεις των νευροδιαβιβαστών και των υποδοχέων τους. Γύρω στις αρχές του αιώνα, άρχισαν να έρχονται σχετικές έρευνες από ερευνητές που χρησιμοποιούσαν ποντίκια knockout, ζώα γενετικά τροποποιημένα ώστε να μην εκφράζουν ένα γονίδιο-στόχο. Τα αποτελέσματα ήταν ανησυχητικά. Η χρώση αντισωμάτων σε ζώα knockout θα έπρεπε να δείχνει ριζικά διαφορετικά μοτίβα από εκείνα των μη τροποποιημένων ζώων. Όμως πολύ συχνά οι εικόνες ήταν πανομοιότυπες. "Καθώς βλέπαμε όλο και περισσότερες αποσύρσεις λόγω αυτού, άρχισα να συνειδητοποιώ ότι δεν είχαμε συστηματικό τρόπο να αξιολογούμε τις εργασίες που χρησιμοποιούσαν αντισώματα", θυμάται ο Saper, σήμερα πρόεδρος νευρολογίας στο Beth Israel Deaconess Medical Center στη Βοστώνη της Μασαχουσέτης.
Έτσι ξεκίνησε μια επανάσταση ενός περιοδικού. Ο Saper και οι συνάδελφοί του στη σύνταξη καθιέρωσαν μια πολιτική που απαιτούσε εκτενή δεδομένα επικύρωσης για κάθε αντίσωμα1. Η πολιτική αυτή ήταν καλή για την αυστηρότητα, αλλά όχι για τις υποβολές, θυμάται ο ίδιος. "Πολλοί συγγραφείς βρέθηκαν στη μέση και βρήκαν ευκολότερο να δημοσιεύσουν τις εργασίες τους αλλού". Αλλά ο Saper επέμεινε. Οι προσπάθειές του κατέληξαν τελικά στη βάση δεδομένων JCN Antibody Database, έναν κατάλογο μερικών χιλιάδων αντισωμάτων που μπορούν να είναι αξιόπιστα για τη νευροανατομία.
Σήμερα, οι βιοϊατρικοί ερευνητές εξακολουθούν να συλλέγουν ιστορίες θλίψης για τα αντισώματα πιο γρήγορα από ό,τι οι δισκογραφικές εταιρείες country μουσικής που βγάζουν λυπητερά τραγούδια. Η πιο συνηθισμένη γκρίνια είναι το αντιδραστήριο που εξαπατά: το αντίσωμα που αγοράστηκε για να ανιχνεύσει την πρωτεΐνη Χ δεσμεύει κρυφά την πρωτεΐνη Υ (και ίσως αγνοεί εντελώς την Χ). Ένα άλλο παράπονο είναι ο "χαμένος θησαυρός": μια σειρά από πολλά υποσχόμενα πειράματα που σταματούν όταν μια νέα παρτίδα αντισωμάτων αποτυγχάνει να αναπαράγει τα προηγούμενα ευρήματα (βλ. "Μια αγορά σε δύσκολη θέση")".
"Είναι ανησυχητική, λοιπόν, η ανακάλυψη ότι τα αντισώματα μπορεί να είναι αναξιόπιστα αντιδραστήρια. Η ανεπαρκής εξειδίκευση, ευαισθησία και η συνέπεια από παρτίδα σε παρτίδα έχουν οδηγήσει σε ψευδή ευρήματα και χαμένες προσπάθειες. Η αναξιοπιστία των αντισωμάτων έχει επιφέρει το τίμημά της σε όλες τις μελέτες στον καρκίνο, τον μεταβολισμό, τη γήρανση, την ανοσολογία και την κυτταρική σηματοδότηση και σε κάθε τομέα που ασχολείται με την έρευνα πολύπλοκων βιομορίων. Η σπατάλη, από την άποψη του χρόνου και των πόρων, είναι κολοσσιαία. Οι απώλειες από την αγορά ανεπαρκώς χαρακτηρισμένων αντισωμάτων υπολογίζονται σε 800 εκατομμύρια δολάρια ετησίως, χωρίς να υπολογίζονται οι επιπτώσεις των λανθασμένων συμπερασμάτων, των μη ερμηνεύσιμων (ή παρερμηνευμένων) πειραμάτων, των χαμένων δειγμάτων ασθενών και του άγονου ερευνητικού χρόνου" [2].
https://www.nature.com/articles/527545a?proof=t
Σύμφωνα με το άρθρο του Nature, τα αντισώματα είναι "αναξιόπιστα αντιδραστήρια". Δεν έχουν εξειδίκευση και ευαισθησία και υπάρχει μεγάλη μεταβλητότητα από παρτίδα σε παρτίδα που εμποδίζει την αναπαραγωγιμότητα. Ο Clifford Saper παρατήρησε αυτή την τάση και το 2005 έγραψε μια ανοιχτή επιστολή προς τους αναγνώστες του περιοδικού Journal of Comparative Neurology για να αντιμετωπίσει αυτή την αυξανόμενη απειλή για την επιστημονική ακεραιότητα. Σε αυτήν περιέγραφε τα προβλήματα που αντιμετωπίζει η έρευνα αντισωμάτων: κυρίως την έλλειψη ειδικότητας και την αδυναμία αναπαραγωγής των αποτελεσμάτων. Έθεσε ορισμένα κριτήρια που έπρεπε να πληρούνται. Η πλήρης επιστολή του παρουσιάζεται παρακάτω:
Ανοιχτή επιστολή προς τους αναγνώστες μας σχετικά με τη χρήση των αντισωμάτων
"Η χρήση της ανοσοϊστοχημείας έχει γίνει πανταχού παρούσα στις νευροεπιστήμες. Η μεγάλη πλειονότητα των εργασιών που δημοσιεύονται τώρα στο The Journal of Comparative Neurology χρησιμοποιεί ανοσοϊστοχημεία, και ορισμένες εργασίες μπορεί να χρησιμοποιούν μια μπαταρία δέκα ή περισσότερων αντισωμάτων για να εξετάσουν θέματα συγκόλλησης ή κυτταρικής τυποποίησης. Αυτό το μοτίβο έχει οδηγήσει σε μια πλημμύρα νέων πληροφοριών. ...αλλά και σε μια πλημμύρα παραπληροφόρησης.
Το περιοδικό έχει επανειλημμένα, τα τελευταία χρόνια, λάβει θλιμμένες ανακοινώσεις από συγγραφείς, οι οποίοι αναγκάστηκαν να αποσύρουν εργασίες επειδή ένα αντίσωμα έναντι ενός νέου δείκτη βρέθηκε να χρωματίζει ιστούς σε ζώα knockout, τα οποία στερούνται την εν λόγω πρωτεΐνη-στόχο. Σε πολλές περιπτώσεις οι εργασίες αυτές περιείχαν προσεκτικό χαρακτηρισμό των αντισωμάτων και ανοσοκυτταροχημικούς ελέγχους. Το θέμα αυτό ευαισθητοποίησε τους συντάκτες στο πρόβλημα της εξειδίκευσης των αντισωμάτων και σύντομα συνειδητοποιήσαμε ότι πολλές από τις εργασίες που δημοσιεύαμε είχαν πολύ περιορισμένο χαρακτηρισμό ή ελέγχους για τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν. Στη συνέχεια οι συντάκτες παρατήρησαν ότι ένας αριθμός εμπορικά διαθέσιμων αντιορών, ιδίως έναντι υποδοχέων συνδεδεμένων με G-πρωτεΐνες, έδιναν σχέδια χρώσης που δεν ταίριαζαν με τις κατανομές του mRNA και ότι τα αντισώματα αυτά εξακολουθούσαν να χρωματίζουν ιστό από ζώα στα οποία ο υποδοχέας είχε τεθεί εκτός λειτουργίας. Θεωρήσαμε ότι η ακεραιότητα της επιστημονικής επικοινωνίας απειλείται από τον πολλαπλασιασμό των ανεπαρκώς χαρακτηρισμένων αντισωμάτων που παράγουν τεχνητά μοτίβα χρώσης και, ως εκ τούτου, καταλήξαμε σε ένα ελάχιστο σύνολο κανόνων για την ταυτοποίηση, τον χαρακτηρισμό και τον έλεγχο της ανοσοϊστοχημείας που προσπαθούμε να εφαρμόσουμε σε όλα τα χειρόγραφα που δημοσιεύουμε (Saper and Sawchenko, 2003).
Το αποτέλεσμα ήταν ένας σημαντικός βαθμός σύγχυσης σχετικά με το ποιες πληροφορίες είναι απαραίτητες για μια εργασία στο JCN (ή σε οποιοδήποτε άλλο περιοδικό, εδώ που τα λέμε), ώστε να παρέχεται ένα λογικό επίπεδο διαβεβαίωσης ότι ένα αντίσωμα αναγνωρίζει πράγματι αυτό που υποτίθεται ότι χρωματίζει. Προς το συμφέρον της περαιτέρω απομυθοποίησης αυτής της διαδικασίας, παρουσιάζουμε την ακόλουθη σύντομη περιγραφή των τριών βασικών στοιχείων που είναι απαραίτητα για την περιγραφή ενός αντισώματος για χρήση στις νευροεπιστήμες:
1.) Πλήρεις πληροφορίες σχετικά με το αντίσωμα. Είναι σημαντικό να αναγνωρίσουμε ότι τα αντισώματα δεν είναι απλά αντιδραστήρια που προσδιορίζουν πάντα το ίδιο πράγμα. Έτσι, για να περιγράψετε ένα αντίσωμα όσο το δυνατόν πληρέστερα, ώστε άλλοι επιστήμονες να μπορούν να αναπαράγουν την εργασία σας, πρέπει να παρέχετε πληροφορίες δύο ειδών:
-Ταυτοποίηση: Ποια ήταν η πηγή του αντισώματος; Εάν ένα άλλο εργαστήριο έχει δωρίσει το αντίσωμα, δώστε τον κωδικό αριθμό του αντιορού και, εάν είναι δυνατόν, την αιμορραγία. Εάν ελήφθη από εμπορικές πηγές, δώστε τον κατάλογο και, εάν είναι δυνατόν, τον αριθμό παρτίδας.
-Προετοιμασία του αντισώματος: Εναντίον τίνος δημιουργήθηκε στην πραγματικότητα το αντίσωμα; Δώστε την ακριβή δομή του ανοσοποιητικού αντιγόνου, όχι μόνο αόριστες πληροφορίες για το τμήμα του μορίου που χρησιμοποιήθηκε. Σε ποιο είδος καλλιεργήθηκε ο αντιορός; Ήταν πολυκλωνικό ή μονοκλωνικό παρασκεύασμα; Λάβετε υπόψη ότι ορισμένοι κατασκευαστές αντισωμάτων προσπαθούν σκόπιμα να αποκρύψουν τις πληροφορίες σχετικά με τη δομή του αντιγόνου. Έχουμε λάβει παράπονα από συγγραφείς ότι αρκετοί κατασκευαστές ισχυρίστηκαν ότι οι πληροφορίες για την αλληλουχία του αντιγόνου ήταν "ιδιοκτησία" και δεν τις παρείχαν. Επειδή οι εργασίες που χρησιμοποιούν αυτά τα αντισώματα είναι εγγενώς μη επαναλήψιμες, τέτοιες εργασίες δεν είναι αποδεκτές για δημοσίευση. Η συμβουλή μας είναι η εξής:
ΜΗΝ ΑΓΟΡΑΖΕΤΕ ΠΟΤΕ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΟΠΟΙΑ Ο ΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΗΣ ΔΕΝ ΑΠΟΚΑΛΥΠΤΕΙ ΤΗ ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ. ΑΥΤΑ ΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΓΙΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ Η ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΟΥ ΘΑ ΚΑΝΕΤΕ ΜΕ ΑΥΤΑ ΔΕΝ ΘΑ ΕΙΝΑΙ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΙΜΗ.
Παραδείγματα περιγραφών αντισωμάτων που θα ήταν αποδεκτές:
"Αυτός ο αντιορός κουνελιού (εταιρεία XYZ #30248) παρασκευάστηκε έναντι ενός συνθετικού πεπτιδίου που αντιπροσωπεύει τα αμινοξέα 121-142 από την υδροξυλάση της τυροσίνης".
"Αυτό το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, που παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. John Smith, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα, δημιουργήθηκε έναντι της ανθρώπινης πλακουντιακής ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης".
2.) Πώς έχει χαρακτηριστεί η ειδικότητα του αντισώματος; Εάν ο αντιορός είναι έναντι μιας μεγάλης πρωτεΐνης, είναι σημαντικό να γνωρίζετε τι χρωματίζει σε πηκτή από τον ιστό και το είδος που χρησιμοποιείτε. Ιδανικά, ένα αντίσωμα θα πρέπει να χρωματίζει μία μόνο ζώνη (ή πολλές ζώνες εάν το αντιγόνο έχει πολλές γνωστές μοριακές διαμορφώσεις) κατάλληλου μοριακού βάρους. Οι πληροφορίες αυτές συχνά περιλαμβάνονται από τον κατασκευαστή στις τεχνικές πληροφορίες και μπορούν να αναφερθούν, όπως και προηγούμενες μελέτες που παρείχαν αυτές τις πληροφορίες. Ωστόσο, δεν αρκεί να αναφέρεται απλώς ότι "αυτός ο αντιορός χαρακτηρίστηκε προηγουμένως (Jones et al., 2002)". Πρέπει να παρέχετε σε έναν λογικά κριτικό κριτή πληροφορίες σχετικά με το τι χαρακτηρισμός έγινε και τι έδειξε.
Παραδείγματα χαρακτηρισμού αντισωμάτων που θα ήταν αποδεκτά:
"Ο αντιορός χρωματίζει μία μόνο ζώνη μοριακού βάρους 55 kD σε Western blot (τεχνικές πληροφορίες του κατασκευαστή)".
"Αυτός ο αντιορός χρωματίζει τις μορφές 150kD αλλά όχι τις μορφές 130kD ή 110kD του μορίου σε Western blot (Εικ. 1).
3.) Ποιοι έλεγχοι είναι απαραίτητοι για την ανοσοχρωματισμό; Μας εκπλήσσει διαρκώς η περίεργη εμπιστοσύνη πολλών συναδέλφων μας, οι οποίοι φαίνεται να πιστεύουν (ή να θέλουν να πιστεύουν) ότι ένα αντίσωμα θα χρωματίσει αυτό που ισχυρίζεται ο κατασκευαστής. Στην πραγματικότητα, σε πολλές περιπτώσεις τίποτα δεν θα μπορούσε να απέχει περισσότερο από την αλήθεια. Είναι πάντα σημαντικό να παρέχετε το υψηλότερο δυνατό επίπεδο ελέγχου για να βεβαιωθείτε ότι το αντίσωμα χρωματίζει αυτό που θέλετε να χρωματίσει.
Ο χρυσός κανόνας από αυτή την άποψη είναι -: χρωματίζει το αντίσωμα τον ιστό ενδιαφέροντος από τον οποίο έχει αφαιρεθεί το μόριο ενδιαφέροντος; Αυτό το πρότυπο είναι εύκολο να επιτευχθεί για αντισώματα έναντι ιχνηθετών, ή βρωμοδεοξυουριδίνης, ή πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης, τα οποία δεν υπάρχουν κανονικά στον ιστό. Παρόμοιο επίπεδο διασφάλισης μπορεί να επιτευχθεί όταν είναι διαθέσιμο ένα ποντίκι νοκ-άουτ (ή άλλο ζώο) (δηλ. εάν το αντίσωμα βάφει ιστό σε ζώο άγριου τύπου και όχι στα ζώα από τα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο). Αλλά αυτό ισχύει μόνο εάν εξετάζετε ιστό από ζώο για το οποίο υπάρχει knockout.
Οι περισσότεροι από εμάς, τις περισσότερες φορές, πρέπει να αρκεστούμε σε μικρότερους βαθμούς βεβαιότητας. Ένας χρήσιμος έλεγχος, ο οποίος είναι ιδιαίτερα σημαντικός για τα αντισώματα που δημιουργούνται έναντι συνθετικών πεπτιδίων, είναι η προαπορρόφηση του αντιορού έναντι του πεπτιδίου. Εάν η χρώση εξαφανιστεί, είναι τουλάχιστον πιθανό ότι το χρωστικό συστατικό του αντιορού έχει πράγματι δημιουργηθεί έναντι του εν λόγω αντιγόνου. Ωστόσο, αυτό δεν σας προστατεύει από άλλες ιστικές πρωτεΐνες που μπορεί να διασταυρωθούν, και είχαμε μια σειρά από εργασίες που τελικά αποσύρθηκαν όταν ένας αντιορός που πέρασε το τεστ προαπορρόφησης αποδείχτηκε ότι χρωμάτιζε επίσης ιστό από ζώα knockout. Αυτή η στρατηγική δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία πάντα θα προσροφώνται από το αντιγόνο τους, ακόμη και αν χρωματίζουν κάτι εντελώς διαφορετικό στον ιστό.
Ελλείψει του αντιγόνου (π.χ. εάν πρόκειται για μεγάλη πρωτεΐνη), υπάρχουν διάφορες εναλλακτικές στρατηγικές για τον καθορισμό της ειδικότητας χρώσης. Εάν το μοτίβο χρώσης του αντιγόνου είναι γνωστό (π.χ. αντισώματα κατά της όξινης ινώδους πρωτεΐνης της γλοίας ή της υδροξυλάσης της τυροσίνης), είναι λογικό να δείξετε ότι ο ιστός του τύπου και του είδους που μελετάτε, όταν χρωματίζεται με το αντίσωμα που διαθέτετε, παράγει ένα μοτίβο που είναι πανομοιότυπο με αυτό που έχει αναφερθεί προηγουμένως. Εναλλακτικά, μερικές φορές μπορεί να αποδειχθεί ότι ένα αντίσωμα (π.χ. ένας μονοκλωνικός αντιορός έναντι μιας μεγάλης πρωτεΐνης) παράγει ένα μοτίβο χρώσης που είναι πανομοιότυπο με έναν άλλο αντιορό (π.χ. ένας πολυκλωνικός ορός έναντι ενός συνθετικού πεπτιδίου) που χαρακτηρίζεται καλύτερα (και περνάει τη δοκιμασία προσρόφησης). Οι αντιοροί έναντι διαφορετικών τμημάτων του ίδιου μορίου που παράγουν το ίδιο μοτίβο χρώσης, ή μπορούν να αποδειχθούν ότι συγκεντρώνουν σε μελέτες διπλής σήμανσης, παρέχουν μια σημαντική στρατηγική για τον καθορισμό της ειδικότητας. Ομοίως, η σύγκριση με το πρότυπο έκφρασης του mRNA με τη χρήση ιστοχημείας υβριδισμού in situ μπορεί να καταδείξει ότι η ανοσοχρώση για την πρωτεΐνη είναι γνήσια.
Σημειώστε ότι οι έλεγχοι παράλειψης (χρώση χωρίς το πρωτογενές αντίσωμα) ΔΕΝ αποτελούν καθόλου ελέγχους για την ειδικότητα του πρωτογενούς αντισώματος. Ελέγχουν μόνο την ειδικότητα του δευτερογενούς αντιορού.
Παραδείγματα αποδεκτών ελέγχων για ανοσοχρωματισμό (κατά φθίνουσα περίπου σειρά αυστηρότητας):
"Δεν παρατηρήθηκε καμία χρώση όταν το αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση ιστού από ποντίκι με νοκ άουτ ορεξίνη".
"Όλες οι χρώσεις καταργήθηκαν όταν 1 ml του αραιωμένου πρωτογενούς αντισώματος προεπωάστηκε με 50 g του ανοσοποιητικού πεπτιδίου".
"Η χρώση με αυτόν τον αντιορό συσχετίστηκε με τον in situ υβριδισμό για το mRNA της ίδιας πρωτεΐνης (Εικ. 3)."
"Αυτός ο αντιορός έναντι των Ν-τελικών 13 αμινοξέων της πρωτεΐνης έδωσε το ίδιο μοτίβο χρώσης με έναν άλλο αντιορό έναντι του C-τελικού θραύσματος βρωμιούχου κυανογόνου της πρωτεΐνης (Smith et al., 2001)."
"Η χρώση των τομών διαμέσου του pons παρήγαγε ένα μοτίβο ανοσοαντιδραστικότητας της υδροξυλάσης της τυροσίνης που ήταν πανομοιότυπο με προηγούμενες περιγραφές (Smith et al., 1992)".
"Ο αντιορός GFAP χρωμάτισε μόνο κύτταρα με την κλασική μορφολογία και κατανομή των ινώδους μορφής αστροκυττάρων (Εικ. 2, βλ. Smith and Jones, 1998)."
Οι πλήρεις πληροφορίες για οποιοδήποτε αντίσωμα συνήθως απαιτούν μόνο δύο ή τρεις προτάσεις. Συχνά οι πληροφορίες αυτές μπορούν να περιέχονται σε έναν πίνακα. Ωστόσο, είναι κρίσιμο ότι για κάθε αντίσωμα που χρησιμοποιείται, οι συγγραφείς πρέπει να παρέχουν επαρκείς πληροφορίες ώστε να διασφαλίζεται ότι το αποτέλεσμα είναι αναπαραγώγιμο και πιθανότατα σωστό. Η τυφλή πίστη ότι το αντίσωμα θα χρωματίσει ό,τι ισχυρίζεται ο κατασκευαστής δεν συνάδει με την καλή επιστήμη.
doi: 10.1002/cne.20839.
Είναι προφανές ότι η αναξιοπιστία των υποβαλλόμενων ερευνητικών εργασιών ήταν ένα πρόβλημα που ο Saper θεωρούσε ότι είχε τεράστιες επιπτώσεις στην επιστημονική ακεραιότητα. Τα ψευδή αποτελέσματα οδηγούσαν σε ένα κύμα παραπληροφόρησης που κατέκλυζε την αγορά. Προφανώς, αυτό είναι μάλλον ανησυχητικό, καθώς αυτό δημιουργεί ένα μοτίβο λανθασμένης έρευνας που βασίζεται σε λανθασμένη έρευνα. Τα λανθασμένα αποτελέσματα παρουσιάζονταν και παρουσιάζονται ακόμη ως γεγονότα. Ο Saper προσπάθησε να εφαρμόσει κάποια επίφαση κατευθυντήριων γραμμών ποιότητας που έπρεπε να ακολουθούν οι ερευνητές προκειμένου να γίνουν δεκτοί στο περιοδικό του. Δυστυχώς, πολλοί αγνόησαν τις εκκλήσεις του και έψαξαν αλλού για να δημοσιεύσουν την έρευνά τους.
Τον Ιανουάριο του 2009, ο Saper έγραψε ένα πιο εμπεριστατωμένο άρθρο που αναλύει τα ζητήματα σχετικά με την εξειδίκευση των αντισωμάτων που οδηγούν σε εσφαλμένη έρευνα. Σε αυτό, επανέλαβε τα ίδια τρία κριτήρια που συμβούλευε τους άλλους να ακολουθήσουν το 2005 προκειμένου να παράγουν "ακριβή" έρευνα. Ανέλυσε τις διαφορές μεταξύ μονοκλωνικών και πολυκλωνικών αντισωμάτων και τα αντίστοιχα ζητήματα που σχετίζονται με την ειδικότητα. Εξήγησε ότι η υπερβολική εξάρτηση από την ανοσοϊστοχημική χρώση έχει τυφλώσει τους ερευνητές στο γεγονός ότι η τεχνική αυτή δεν μπορεί να προσδιορίσει με ακρίβεια τους μοριακούς στόχους. Ενώ ο Saper προσέφερε πολλές μεθόδους για την προσπάθεια επικύρωσης των αντισωμάτων, καθεμία από αυτές είναι προβληματική με τον τρόπο της. Τελικά κατέληξε στο συμπέρασμα ότι οι ερευνητές ανακαλύπτουν πάντα νέους τρόπους με τους οποίους η φύση μπορεί να ξεγελάσει και εξαιτίας αυτού, κανένας εντοπισμός αντισώματος δεν είναι τέλειος:
Ένας οδηγός για τους μπερδεμένους σχετικά με την εξειδίκευση των αντισωμάτων
Περίληψη
"Πολλοί ερευνητές αγνοούν τα πιθανά προβλήματα με την ειδικότητα των αντισωμάτων και την ανάγκη να τεκμηριώνεται σχολαστικά ο χαρακτηρισμός του αντισώματος για κάθε αντίσωμα που χρησιμοποιείται. Στην παρούσα ανασκόπηση εξετάζω τις αρχές της δράσης των αντισωμάτων και πώς αυτές καθορίζουν ένα σύνολο κανόνων για το ποιες πληροφορίες πρέπει να λαμβάνει ο ερευνητής πριν χρησιμοποιήσει ένα αντίσωμα σε μια σοβαρή επιστημονική έρευνα. (J Histochem Cytochem 57:1-5, 2009)
Από την περιγραφή της έμμεσης ανοσοϊστοχημικής χρώσης (IHC) από τον Coons (1958), η χρώση IHC έχει γίνει μια τυπική μέθοδος που χρησιμοποιείται στα περισσότερα εργαστήρια που κάνουν κυτταρικό ή συστημικό εντοπισμό πρωτεϊνών και άλλων κυτταρικών συστατικών. Στην πραγματικότητα, οι μέθοδοι έχουν γίνει τόσο καθημερινές ώστε πολλοί σημερινοί επαγγελματίες θεωρούν δεδομένο ότι ένα αντίσωμα που πωλείται για τον εντοπισμό ενός συγκεκριμένου μοριακού στόχου θα είναι τόσο ευαίσθητο όσο και ειδικό. Στη σημερινή εποχή των πολύ ακριβών αναλύσεων DNA με υβριδισμό in situ, αναλύσεις με τσιπ DNA και βαθιά αλληλούχιση, συχνά υποτίθεται ότι η IHC έχει ανάλογη ικανότητα να προσδιορίζει με ακρίβεια τους μοριακούς στόχους.
Τίποτα δεν θα μπορούσε να απέχει περισσότερο από την αλήθεια.
Στην πραγματικότητα, οι μέθοδοι IHC παραμένουν τόσο πρωτόγονες, όσον αφορά τόσο την ευαισθησία όσο και την ειδικότητα, όσο ήταν τις ημέρες που η αλληλούχιση του DNA γινόταν με το χέρι χρησιμοποιώντας πηκτές αλληλούχισης. Οι θεμελιώδεις αρχές στις οποίες βασίζεται ο εντοπισμός των αντισωμάτων δεν έχουν βελτιωθεί καθόλου τις τελευταίες δύο δεκαετίες και, αν μη τι άλλο, ο κατήφορος που καταλαμβάνει ο IHC έχει γίνει πιο ολισθηρός από ποτέ".
Με τη συνένωση μεμονωμένων κυττάρων που παράγουν αντισώματα με κύτταρα μυελώματος που παράγουν αντισώματα, τα μεμονωμένα κύτταρα μπορούν να αθανατιστούν, έτσι ώστε να διαιρούνται σε αποικίες κυττάρων "υβριδώματος", τα οποία παράγουν όλα την ίδια, πανομοιότυπη ανοσοσφαιρίνη, με την ίδια μεταβλητή περιοχή. Αυτά τα μονοκλωνικά αντισώματα έχουν την ιδιότητα να δεσμεύονται μόνο σε μόρια που δεσμεύουν αυτή τη μοναδική μεταβλητή περιοχή. Παρόλο που η σχέση αυτή προσδίδει εξειδίκευση στην αλληλεπίδραση, είναι πιθανό η μεταβλητή περιοχή να προσδένεται σε μια ποικιλία διαφορετικών στόχων, ιδίως όταν εξετάζονται σε διαφορετικούς ιστούς, και αυτοί να είναι αρκετά διαφορετικοί από το μόριο έναντι του οποίου έχει εκτραφεί το αντίσωμα".
Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι πολυκλωνικών αντισωμάτων
"Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η πρόσβαση σε μονοκλωνικά αντισώματα μας έχει παράσχει αντισώματα που είναι καθαρά αντιδραστήρια. Τα μονοκλωνικά αντισώματα προέρχονται από κύτταρα υβριδώματος, τα οποία αναπτύσσονται είτε σε καλλιέργεια είτε με ενδοπεριτοναϊκή έγχυσή τους σε ζώο-ξενιστή. Όταν τα κύτταρα υβριδώματος καλλιεργούνται ενδοπεριτοναϊκά, τα ζώα ξενιστές σχηματίζουν υγρό, το οποίο ονομάζεται ασκίτης και το οποίο μπορεί να αναρροφηθεί από την κοιλιά και περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων. Είτε το υγρό καλλιέργειας είτε το υγρό ασκίτη που περιέχει τα αντισώματα μπορεί να υποβληθεί σε καθαρισμό με καθίζηση των αντισωμάτων με πρωτεΐνη Α. Τα σχετικά καθαρά παρασκευάσματα αντισωμάτων που προκύπτουν ποσοτικοποιούνται με βάση τα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης.
Οι πολυκλωνικοί αντιοροί, αντίθετα, προέρχονται από την αφαίμαξη των ζώων μερικές εβδομάδες μετά την ανοσοποίησή τους. Συνήθως χορηγούνται αρκετές "αναμνηστικές ανοσοποιήσεις" και λαμβάνονται αρκετές αιμορραγίες. Ο όγκος αίματος σε ένα θηλαστικό είναι συνήθως ∼7% του σωματικού βάρους και συνήθως ∼10-15% του συνολικού όγκου αίματος μπορεί να αφαιρείται κάθε φορά χωρίς τραυματισμό του ζώου. Ως εκ τούτου, μια απλή αιμορραγία από ένα κουνέλι βάρους 3 κιλών μπορεί να είναι 25 ml, ενώ μια αιμορραγία από μια κατσίκα βάρους 30 κιλών μπορεί να είναι 250 ml. Όταν τα ερυθρά αιμοσφαίρια περιστρέφονται από το θρομβωμένο αίμα, ο εναπομένοντας ορός είναι συνήθως περίπου το μισό αυτού του όγκου. Κατά συνέπεια, μια απλή αιμορραγία από ένα μεγαλύτερο ζώο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για πολύ μεγαλύτερο αριθμό αντιδράσεων IHC από ό,τι μια αιμορραγία από ένα μικρότερο ζώο. Το πλεονέκτημα της μεγαλύτερης ποσότητας ορού ανά αιμορραγία είναι ότι κάθε αιμορραγία είναι ουσιαστικά ένας μοναδικός συνδυασμός κλώνων αντισωμάτων. Ακόμη και όταν ενισχύεται το ίδιο ζώο με επαναλαμβανόμενες ανοσοποιήσεις με το ίδιο αντιγόνο, η περιεκτικότητα σε αντισώματα σε διαδοχικές αιμορραγίες μπορεί να διαφέρει σημαντικά. Ως εκ τούτου, η παρτίδα για έναν πολυκλωνικό αντιορό είναι κρίσιμη και ακόμη και μια άλλη παρτίδα από το ίδιο ζώο μπορεί να έχει εντελώς διαφορετικές ιδιότητες χρώσης. Για το λόγο αυτό, οι έμπειροι ανοσοϊστοχημικοί καταγράφουν τους αριθμούς παρτίδας για κάθε φιαλίδιο αντιορού και, όταν έχουν μια καλή παρτίδα, αγοράζουν τόση ποσότητα από αυτή την παρτίδα όση είναι πιθανό να χρειαστούν στο άμεσο μέλλον για να αποφύγουν την αδυναμία ολοκλήρωσης ενός έργου.
Συνθετικά πεπτιδικά αντιγόνα και χαρτογράφηση αντιγόνων
Η δυνατότητα δημιουργίας συνθετικών πρωτεϊνών και πεπτιδίων έχει φέρει επανάσταση στον τρόπο με τον οποίο μπορούν να παραχθούν αντισώματα και στον τρόπο με τον οποίο μπορούν να χαρακτηριστούν. Τα συνθετικά πεπτίδια έχουν συνήθως μήκος από λίγα αμινοξέα έως ∼25 ή 30 αμινοξέα. Η τρέχουσα τεχνολογία σύνθεσης πεπτιδίων έχει ως αποτέλεσμα να μειώνονται οι αποδόσεις καθώς το πεπτίδιο μακραίνει, έτσι ώστε τα συνθετικά πεπτίδια πολύ μεγαλύτερου μήκους από αυτό, αν και είναι δυνατά, να μην είναι πρακτικά εφαρμόσιμα. Από την άλλη πλευρά, πολύ μεγαλύτερες αλληλουχίες αμινοξέων μπορούν να παρασκευαστούν με ανασυνδυασμένη τεχνολογία, στην οποία μια αντίστοιχη αλληλουχία νουκλεϊνικού οξέος εκφράζεται είτε σε ένα κυτταρικό σύστημα έκφρασης πρωτεϊνών είτε σε ένα σύστημα έκφρασης πρωτεϊνών χωρίς κύτταρα. Φαίνεται προφανές ότι η ακριβής αλληλουχία που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία του αντισώματος είναι κρίσιμη για τις ιδιότητές του και, ως εκ τούτου, θα επανέλθουμε στο θέμα αυτό στα κριτήρια καταλληλότητας του αντισώματος.
Ταυτόχρονα, η διαθεσιμότητα αλληλουχιών αμινοξέων από διάφορα μέρη του μητρικού μορίου-στόχου μας επέτρεψε να προσδιορίσουμε τις θέσεις-στόχους στο εγγενές μόριο στις οποίες προσδένεται το αντίσωμα. Όταν το αντίσωμα προσδένεται σε μια μερική αλληλουχία ή μια μερική αλληλουχία ανταγωνίζεται τη σύνδεση με το εγγενές μόριο, ο επίτοπος ή τα δομικά χαρακτηριστικά που αναγνωρίζει το αντίσωμα θεωρείται ότι βρίσκονται σε αυτή την αλληλουχία. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τη χαρτογράφηση του επιτόπου που δεσμεύει το αντίσωμα. Ωστόσο, αυτό δεν υποδεικνύει ποια ήταν η αλληλουχία του αρχικού ανοσογόνου, διότι το αντίσωμα μπορεί να έχει παραχθεί έναντι μιας αλληλουχίας που επικαλύπτεται".
Αντισώματα έναντι διαφορετικών τμημάτων του ίδιου μορίου
Ένα συναφές θέμα είναι η δυνατότητα παραγωγής αντισωμάτων έναντι συνθετικών πεπτιδίων που προέρχονται από διαφορετικά συστατικά του ίδιου μορίου. Έτσι, είναι δυνατόν, για παράδειγμα, να έχουμε αντισώματα έναντι ενός μεγάλου πρωτεϊνικού στόχου που να δεσμεύονται ειδικά στα Ν- ή στα C-τελικά τμήματα της πρωτεΐνης. Αυτή η δυνατότητα μας δίνει ένα ισχυρό δυνητικό εργαλείο για τον προσδιορισμό της ειδικότητας των αντισωμάτων. Όταν τα δύο διαφορετικά αντισώματα χρωματίζουν ακριβώς το ίδιο μοτίβο, είναι πολύ πιθανό να χρωματίζουν τον σωστό στόχο.
Αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένων ή γλυκοζυλιωμένων επιτόπων
Μια άλλη δυνατότητα που παρέχει η χρήση συνθετικών αντιγόνων είναι η παρασκευή ανοσογόνων που έχουν τροποποιηθεί ειδικά, για παράδειγμα, με φωσφορυλίωση, γλυκοζυλίωση ή κάποια άλλη μετα-μεταφραστική τροποποίηση. Τα αντισώματα που παρασκευάζονται με αυτόν τον τρόπο μπορεί να είναι σε θέση να διακρίνουν με μεγάλη ακρίβεια μεταξύ διαφορετικών τροποποιημένων μορφών του ίδιου μορίου. Ωστόσο, η επίδειξη αυτής της εξειδίκευσης απαιτεί κατάλληλους ελέγχους (όπως χρώση μετά από αποφωσφορυλίωση)".
Κανόνες για να κριθεί εάν ένα αντίσωμα δείχνει αυτό που αναμένεται στον ιστό
"Οι περισσότεροι ερευνητές θέλουν να χρησιμοποιήσουν αντισώματα για τον εντοπισμό κυτταρικών συστατικών και δεν θέλουν να γίνουν ειδικοί στην ανοσολογία ή στην IHC για να το κάνουν αυτό. Ως εκ τούτου, είναι χρήσιμο να υπάρχει ένα σύνολο κριτηρίων για το τι συνιστά εύλογο βαθμό βεβαιότητας ότι το αντίσωμα που χρησιμοποιείται στοχεύει πράγματι το σωστό αντιγόνο. Οι απαντήσεις στα ερωτήματα που ακολουθούν είναι αυτές που πρέπει να θέτουν οι ερευνητές για κάθε αντίσωμα που αποκτούν, πριν το χρησιμοποιήσουν ποτέ σε ένα πείραμα (γιατί να σπαταλούν χρόνο σε ένα άκυρο αντίσωμα;). Εάν όλοι οι ερευνητές ακολουθούσαν αυτούς τους κανόνες, η βιβλιογραφία θα ήταν πολύ πιο ακριβής και οι ερευνητές θα απέφευγαν να σπαταλούν πολύ χρόνο σε άκυρα αντισώματα.
Ποιο ανοσογόνο χρησιμοποιείται για την αύξηση του αντισώματος;
Το πρώτο κρίσιμο κριτήριο για τον εντοπισμό ενός έγκυρου αντισώματος είναι ότι πρέπει να είναι γνωστό το ανοσογόνο έναντι του οποίου έχει εκτραφεί το αντίσωμα. Μια βασική αρχή της επιστήμης είναι ότι η εργασία πρέπει να είναι επαναλήψιμη. Ως εκ τούτου, εάν το αντίσωμα έχει εκτραφεί έναντι ενός "ιδιόκτητου" αντιγόνου (συνήθως μια μυστική αλληλουχία αμινοξέων, για να αποφευχθεί η αντιγραφή του προϊόντος από τους ανταγωνιστές), απλώς δεν είναι έγκυρο για σοβαρή επιστημονική εργασία. Ορισμένοι κατασκευαστές ισχυρίστηκαν ότι η "πνευματική τους ιδιοκτησία" πρέπει να προστατευθεί εάν πρόκειται να παρέχουν αντισώματα στο μέλλον, αλλά στην πραγματικότητα, αυτό έχει γίνει μια διαδικασία ρουτίνας, και για τα περισσότερα αντισώματα υπάρχουν πολλοί κατασκευαστές που παρέχουν την αλληλουχία για τα αντιγόνα τους. Το πιο σημαντικό είναι ότι, αν η προστασία των κερδών τους παρεμποδίζει την επιστήμη, η χρήση του προϊόντος τους είναι αυτή που πρέπει να εξαλειφθεί. Άλλοι κατασκευαστές έχουν ισχυριστεί ότι θα παρέχουν το ιδιόκτητο προϊόν τους σε άλλα εργαστήρια στο μέλλον, έτσι ώστε το αποτέλεσμα του πειράματος να είναι επαναλήψιμο. Ωστόσο, υπάρχει τεράστιος κύκλος εργασιών σε αυτόν τον τομέα και οι εταιρείες ειλικρινά δραστηριοποιούνται για να αποκομίσουν κέρδη και όχι για να προστατεύσουν την επιστημονική ακεραιότητα. Αν διαπιστώσουν αύριο το πρωί ότι μπορούν να βγάλουν μεγαλύτερο κέρδος πουλώντας παπούτσια παρά αντισώματα, αυτό ακριβώς θα κάνουν, και κανείς δεν θα μπορεί να επαναλάβει την εργασία. Ως εκ τούτου, ένα βασικό ζήτημα κατά την αγορά οποιουδήποτε νέου αντισώματος είναι η αποφυγή προϊόντων για τα οποία δεν παρέχεται η ταυτότητα του ανοσογόνου κατά τη στιγμή της αγοράς.
Ποια είναι τα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το αντίσωμα δεσμεύει συγκεκριμένα το αναμενόμενο μόριο-στόχο στον ιστό ενδιαφέροντος;
Το δεύτερο βασικό κριτήριο για τη χρήση ενός αντισώματος σε ένα επιστημονικό έργο θα πρέπει να είναι η απόκτηση τουλάχιστον εύλογων αποδείξεων ότι το αντίσωμα όντως συνδέεται με τον αναμενόμενο στόχο του στον ιστό στον οποίο θα μελετηθεί και όχι με κάτι άλλο. Αυτό παρέχεται συχνά από ένα Western blot, το οποίο θα πρέπει να δείχνει ότι το αντίσωμα βάφει μια μεμονωμένη ζώνη (ή ένα σύνολο ζωνών) κατάλληλης μοριακής μάζας για τον συγκεκριμένο στόχο. Σημειώστε ότι εάν χρωματίζονται ξένες ζώνες, αυτό υποδηλώνει ότι το αντίσωμα έχει άλλους πρόσθετους στόχους στον ιστό και θα πρέπει να εγείρει κόκκινες σημαίες κατά της χρήσης του εν λόγω αντισώματος για IHC, εκτός εάν έχετε λάβει πρόσθετες προφυλάξεις. Για παράδειγμα, έχουμε δει συγγραφείς να παίρνουν ιστό από ποντίκια στα οποία η πρωτεΐνη-στόχος έχει διαγραφεί (όπως φαίνεται από τη Western blot) και να προσροφούν τον αντιορό έναντι ιστού από το ποντίκι με το knockout πριν τον χρησιμοποιήσουν για τη χρώση του εγκεφάλου. Πρόκειται για έναν υπέροχο έλεγχο που αφαιρεί την ξένη χρώση και παρέχει ισχυρή εμπιστοσύνη ότι αυτό που χρωματίζεται είναι το μόριο-στόχος.
Σημειώστε τη σημασία της πραγματοποίησης του Western blot στον ίδιο ιστό και στο ίδιο είδος με το αντίσωμα που θα εφαρμοστεί για την IHC. Είναι πολύ πιθανό το αντίσωμα να δει μόνο μία ζώνη σε ορισμένους ιστούς αλλά να δει πολλαπλές ξένες ζώνες σε άλλους ιστούς από το ίδιο ζώο. Παρομοίως, οι κατασκευαστές συχνά προσπαθούν να "αποδείξουν" την ειδικότητα εκτελώντας το αντίσωμα έναντι ενός παρασκευάσματος πηκτής από καθαρισμένη ή ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη. Αυτό μπορεί να δείξει ότι το αντίσωμα μπορεί να προσδεθεί στο στόχο του, αλλά δεν λέει τίποτα για το με τι άλλο μπορεί να προσδεθεί στον ιστό.
Ποιοι έλεγχοι μπορούν να γίνουν για να διασφαλιστεί ότι το αντίσωμα συνδέεται σε σταθερό ιστό μόνο με το μόριο-στόχο του;
Παρά τις προσπάθειές μας να διασφαλίσουμε την ειδικότητα του αντισώματος έναντι των εγγενών πρωτεϊνών στην υδατική φάση, τελικά πρέπει να το εφαρμόσουμε σε σταθερό ιστό. Στη σταθεροποιημένη κατάσταση, είναι πιθανό το αντίσωμα που λειτουργεί καλά σε ένα Western blot να διαπιστώσει ότι το αντιγόνο-στόχος του έχει παραμορφωθεί από τη διαδικασία σταθεροποίησης και δεν είναι πλέον αναγνωρίσιμο. Στην πραγματικότητα, αυτό συμβαίνει τόσο συχνά ώστε οι περισσότεροι κατασκευαστές επισημαίνουν τους αντιορούς ως χρησιμοποιήσιμους για Western blotting ή IHC, και οι τελευταίες είναι μακράν οι σπανιότερες.
Όταν οι πολυκλωνικοί αντιοροί εκτρέφονται έναντι ενός πεπτιδικού αντιγόνου, είναι σύνηθες ότι οι περισσότεροι από τους αντιορούς που παράγονται θα χρωματίσουν τον σταθεροποιημένο ιστό ελάχιστα ή καθόλου. Σε μια περίπτωση στην οποία ο συγγραφέας εξέτασε τους αντιορούς, βρήκαμε μόνο 2 από τους 31 έναντι μιας κοινής πεπτιδικής ορμόνης που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη χρώση εγκεφαλικού ιστού. Εάν εφαρμόσει κανείς τα μαθηματικά της κατανομής Poisson σε αυτό το πρόβλημα (δηλαδή, υποθέσει ότι η πιθανότητα διέγερσης ενός μόνο κλώνου αντισώματος που αναγνωρίζει το σταθεροποιημένο μόριο είναι ένα ανεξάρτητο γεγονός), είναι πιθανό ότι, στους περισσότερους πολυκλωνικούς ορούς, ο αντιορός χρωματίζει τον ιστό με έναν μόνο ή το πολύ μικρό αριθμό κλώνων αντισωμάτων (δηλ, ότι ο πολυκλωνικός, ο οποίος μπορεί να περιέχει χιλιάδες κλώνους έναντι άλλων αντιγόνων που συνάντησε το ζώο-ξενιστής κατά τη διάρκεια της ζωής του, είναι λειτουργικά μονοκλωνικός ή ολιγοκλωνικός για το σκοπό αυτό).
Μια από τις καλύτερες δοκιμές για να αποδειχθεί ότι το αντίσωμα μπορεί να εντοπίσει τον στόχο του σε σταθερό ιστό είναι να μεταγγιστεί το DNA της πρωτεΐνης-στόχου σε κύτταρα που κανονικά δεν την παράγουν στην καλλιέργεια ιστών. Τα διαμολυσμένα και τα μη διαμολυσμένα κύτταρα ελέγχου μπορούν στη συνέχεια να σταθεροποιηθούν και να χρωματιστούν, και η παρουσία χρώσης στα διαμολυσμένα κύτταρα δείχνει ότι το αντίσωμα όντως χρωματίζει το στόχο του. Ωστόσο, αυτός ο έλεγχος δεν αποδεικνύει ότι το αντίσωμα θα χρωματίσει το στόχο του μόνο στον ιστό που μας ενδιαφέρει.
Ένας άλλος έλεγχος για την ειδική χρώση στον ιστό είναι η δοκιμασία προαπορρόφησης. Η ανάμειξη του αραιωμένου αντισώματος με περίσσεια του ανοσογόνου θα πρέπει να εμποδίζει πλήρως τη χρώση. Αυτό δείχνει ότι η χρώση στον ιστό γίνεται έναντι κάτι που είναι τουλάχιστον διασταυρούμενα αντιδραστικό με την αρχική πρωτεΐνη (αν και δεν αποδεικνύει ότι αυτός είναι πράγματι ο στόχος στον ιστό). Γενικά, όταν το αρχικό ανοσογόνο είναι εύκολα διαθέσιμο, όπως για παράδειγμα για ένα συνθετικό πεπτίδιο, η δοκιμή προαπορρόφησης πρέπει να εκτελείται αυτονόητα. Αυτό είναι λιγότερο πρακτικό για μεγάλα πρωτεϊνικά μόρια και αντισώματα έναντι μερικώς καθαρισμένων συστατικών ιστών. Σημειώστε ότι ο έλεγχος προαπορρόφησης δεν έχει νόημα για ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (το οποίο παράγεται με διαλογή ως προς τη σύνδεσή του με τον στόχο και, επομένως, θα τον δεσμεύει πάντα και θα περνάει πάντα τη δοκιμή προαπορρόφησης, εξ ορισμού) και για αντισώματα που έχουν ήδη καθαριστεί με συγγένεια (για τον ίδιο λόγο).
Πρακτικά, οι καλύτεροι έλεγχοι για να διασφαλιστεί ότι η χρώση στον ιστό είναι το μόριο-στόχος περιλαμβάνουν μία από τις δύο προσεγγίσεις (Lorincz and Nusser 2008). Πρώτον, εάν η χρώση αξιολογείται σε ποντίκια ή σε στενά συγγενικό είδος τρωκτικού και υπάρχει στέλεχος στο οποίο το μόριο-στόχος έχει διαγραφεί, η απουσία χρώσης αποτελεί ισχυρή επιβεβαίωση της ειδικότητας. Δυστυχώς, αυτό δεν είναι μια τέλεια δοκιμή, διότι ο στόχος που χρωματίζεται στον ιστό μπορεί να είναι ένα συγγενικό μόριο που είναι υπορυθμισμένο στο ζώο που έχει υποστεί νοκ άουτ. Επιπλέον, η προσέγγιση αυτή εφαρμόζεται μόνο σε περιπτώσεις όπου υπάρχει διαθέσιμη στρατηγική knockout, γεγονός που την περιορίζει σε λίγα είδη-μοντέλα. Τέλος, σε πολλά λεγόμενα ποντίκια knockout, η αρχική πρωτεΐνη δεν εξαλείφεται εντελώς. Εάν εξακολουθεί να εκφράζεται μόνο ένα τμήμα της εν λόγω πρωτεΐνης, μπορεί να μην έχει λειτουργική παρουσία αλλά να εξακολουθεί να χρωματίζεται με το αντίσωμά σας. Ως εκ τούτου, είναι κρίσιμο σε έναν έλεγχο knockout να βεβαιωθείτε ποια είναι η πραγματική κατασκευή γονιδίου και τι εκφράζεται πραγματικά.
Η δεύτερη μοριακή προσέγγιση για την επιβεβαίωση της ταυτότητας της χρώσης αναφέρθηκε παραπάνω στην ενότητα σχετικά με την κατασκευή αντισωμάτων έναντι διαφορετικών συστατικών του ίδιου μορίου-στόχου. Όταν τα δύο αντισώματα παρασκευάζονται στο ίδιο είδος, η επίδειξη ότι τα μοτίβα χρώσης είναι πολύ παρόμοια είναι ένας ισχυρός έλεγχος. Όταν τα δύο αντισώματα παρασκευάζονται σε διαφορετικά είδη, η ταυτόχρονη χρώση και η επίδειξη του συγκολλητισμού είναι ένας ακόμη πιο ικανοποιητικός και πειστικός έλεγχος.
Οι μέθοδοι που περιγράφονται ανωτέρω δεν είναι σε καμία περίπτωση εξαντλητικά λεπτομερείς. Υπάρχουν πολλοί έξυπνοι και καινοτόμοι τρόποι που εντοπίζονται από τους ερευνητές για τον έλεγχο των αντισωμάτων τους κάθε χρόνο. Η επιστήμη είναι ατελείωτα δημιουργική και πάντα βρίσκουμε νέες μεθόδους και τρόπους βελτίωσης παλαιότερων μεθόδων. Ταυτόχρονα, αποκαλύπτουμε πάντα νέους τρόπους με τους οποίους η φύση μπορεί να μας ξεγελάσει. Έτσι, κανένας εντοπισμός αντισωμάτων δεν είναι πραγματικά τέλειος, αν και η τήρηση του πρακτικού οδηγού που παρέχεται εδώ θα βοηθήσει τους ερευνητές, ιδίως εκείνους που είναι νέοι στα μυστήρια της IHC, να διασφαλίσουν την επιστημονική ακεραιότητα της εργασίας τους".
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2605712/
Τα κυριότερα σημεία από τις επόμενες δύο μελέτες δεν αφορούν τον Clifford Saper, αλλά βοηθούν να φανεί ότι αυτή η έλλειψη εξειδίκευσης είναι ένα πρόβλημα που δεν αναγνώρισε μόνο ο ίδιος. Το 2014, ένα άρθρο εξέτασε το κριτικά παραγνωρισμένο και ελάχιστα μελετημένο πρόβλημα της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας στα αντισώματα. Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα αναφέρεται στην αντιδραστικότητα ενός παρατηρούμενου παράγοντα που ξεκινά αντιδράσεις εκτός της κύριας αναμενόμενης αντίδρασης. Με άλλα λόγια, το αντίσωμα στοχεύει σε ένα άλλο αντιγόνο με παρόμοια δομή και όχι σε αυτό που στοχεύουν οι ερευνητές. Προφανώς, αυτό θα αποτελούσε πρόβλημα όταν προσπαθούμε να προσδιορίσουμε την ειδικότητα, η οποία αφορά τη δέσμευση ενός αντισώματος μόνο στο σωστό στόχο. Αυτό οδηγεί σε λανθασμένα αποτελέσματα και λανθασμένα συμπεράσματα:
Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε μικροσυστοιχίες αντισωμάτων και πολυπλεγμένες δοκιμασίες σάντουιτς: ρίχνοντας φως στη σκοτεινή πλευρά της πολυπλεξίας
"Οι ανοσοδοκιμασίες είναι απαραίτητες για την έρευνα και την κλινική ανάλυση και μετά την εμφάνιση του παραδείγματος των omics, η πολυπλεξία των ανοσοδοκιμασιών είναι πιο αναγκαία από ποτέ. Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα (CR) σε πολυπλεγμένους ανοσοδοκιμασίες ήταν απροσδόκητα δύσκολο να μετριαστεί, εμποδίζοντας την κλιμάκωση της πολυπλεξίας, περιορίζοντας την απόδοση της ανάλυσης και οδηγώντας σε ανακριβή ή και ψευδή αποτελέσματα και λανθασμένα συμπεράσματα".
Εισαγωγή
"Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα (CR) σε πρωτεΐνες που δεν αποτελούν στόχο είναι πανταχού παρούσα και ευρέως διαδεδομένη για τα αντισώματα (Abs) [1,2-] και μαζί με την έλλειψη Abs έναντι πολλών στόχων, αποτελεί αναμφισβήτητα το μεγαλύτερο εμπόδιο στην καθιέρωση ανοσοδοκιμών υψηλής απόδοσης και μεγάλης κλίμακας πολυπλεξίας. Εάν η CR δεν αντιμετωπιστεί επαρκώς και δεν κατασταλεί, ή τουλάχιστον δεν μετριαστεί, μπορεί να αποβεί καταστροφική για την απόδοση και την αξιοπιστία των ανοσολογικών δοκιμών. Η CR δεν αποτελεί κυρίαρχο επιστημονικό πεδίο έρευνας και θεωρείται μάλλον εμπόδιο και, ως εκ τούτου, λαμβάνει ελάχιστη προσοχή σε σύγκριση με εκείνη που αφιερώνεται στην ανάπτυξη νέων τεχνολογιών και μεθόδων ανάλυσης, όπως οι μικροσυστοιχίες αντισωμάτων και οι αναλύσεις υψηλής ευαισθησίας. Κατά ειρωνικό τρόπο, η πρόοδος στην ανάπτυξη και εφαρμογή νέων τεχνολογιών δοκιμών συχνά εμποδίζεται από την CR.
Οι ανοσολογικές αναλύσεις εξαρτώνται από ένα συνδετικό υλικό συγγένειας - ένα πολυκλωνικό ή μονοκλωνικό ΑΒ, ένα ανασυνδυασμένο συνδετικό υλικό, ένα απταμερές ή έναν υποδοχέα - που δεσμεύει μια πρωτεΐνη-στόχο με υψηλή ειδικότητα και συγγένεια. Η πρόσδεση μετασχηματίζεται και ενισχύεται σε ανιχνεύσιμο σήμα και, στο ιδανικό σενάριο, η ένταση του σήματος είναι αναλογικομετρική με τη συγκέντρωση του αναλύτη-στόχου. Η βελτίωση των ανοσολογικών δοκιμών εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα και την ποιότητα των συνδετών συγγένειας και η ανάγκη για περισσότερους, καλύτερους και φθηνότερους συνδετές αναγνωρίζεται ευρέως [3,4]. Η CR των συνδετών συγγένειας μπορεί να ελεγχθεί με τη χρήση τυχαίων πεπτιδικών συστοιχιών για παράδειγμα, αλλά η CR σε μη ομόλογες αλληλουχίες αμινοξέων βρέθηκε ότι είναι ευρέως διαδεδομένη [5]. Η καταστολή της CR περιπλέκεται περαιτέρω από τον μεγάλο χώρο παραμέτρων των πιθανών τρισδιάστατων διαμορφώσεων που υιοθετούν οι πρωτεΐνες [6]. Το Human Protein Atlas δημιούργησε έναν αγωγό παραγωγής πολυκλωνικών Ab με αυστηρά πρότυπα ποιοτικού ελέγχου και, σε μια ηράκλεια προσπάθεια, παρήγαγε Abs έναντι 15 000 από τις 20 000 ανθρώπινες πρωτεΐνες (Human Protein Atlas- URL: http://www.proteinatlas.org/). Ωστόσο, όταν οι Schwenk et al. αξιολόγησαν μια προεπιλογή 11.000 καθαρισμένων με συγγένεια, μονοειδικών Abs, μόνο 531 Abs παρήγαγαν μια ενιαία ζώνη σε μια κηλίδα Western, υποδεικνύοντας ότι το 95% προσδέθηκε σε πρωτεΐνες εκτός της αναμενόμενης ζώνης [7]. Ενώ ένα μέρος της δέσμευσης μπορεί να αποδοθεί σε ισομορφές πρωτεϊνών, διασπασμένες πρωτεΐνες ή μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, ένα μεγάλο μέρος είναι πιθανό να προκαλείται από την CR. Συλλογικά, οι μελέτες αυτές υπογραμμίζουν ότι οι δεσμευτές συγγένειας συχνά διασταυρώνονται".
"Η CR και η μη ειδική δέσμευση έχουν μελετηθεί εκτενώς για δοκιμασίες single-plex, και ενώ μπορεί να μην είναι δυνατή η πλήρης εξάλειψή της, είναι αρκετά καλά κατανοητή και διαχειρίσιμη [10]. Οι δοκιμασίες διπλού Ab, που ονομάζονται επίσης δοκιμασίες σάντουιτς και συχνά αναφέρονται απλώς ως ενζυμικά συνδεδεμένες ανοσοπροσροφητικές δοκιμασίες (ELISA) ενσωματώνουν μια αποτελεσματική στρατηγική για τον μετριασμό της CR με τη δέσμευση δύο διαφορετικών επιτόπων στην ίδια πρωτεΐνη: ένα Ab σύλληψης (cAb) ακινητοποιεί και συγκεντρώνει τον αναλύτη, ενώ η ταυτόχρονη δέσμευση ενός σημασμένου Ab ανίχνευσης (dAb) μετατρέπει τη δέσμευση σε ανιχνεύσιμο σήμα (Εικόνα 1γ). Η ισχύς της δοκιμασίας σάντουιτς πηγάζει από την ανοχή της στην CR, επειδή μια απλή CR (ή μη ειδική πρόσδεση) δεν οδηγεί σε ανιχνεύσιμο (ψευδώς θετικό) σήμα (Εικόνα 1δ).
Πράγματι, απαιτούνται δύο ταυτόχρονες ψευδείς δεσμεύσεις για να οδηγήσουν σε ανιχνεύσιμο CR, αλλά οι πιθανότητες να συμβεί αυτό είναι πολύ χαμηλές. Το σημείο αυτό υπογραμμίζει τη σημασία της διάκρισης μεταξύ της CR που οδηγεί σε ψευδώς θετικά σήματα και της CR που δεν οδηγεί σε σήμα και η οποία μπορεί να γίνει ανεκτή, αλλά δεν πρέπει να αγνοηθεί. Σε όλες τις περιπτώσεις, η CR μπορεί να ελαχιστοποιηθεί περαιτέρω με την αναζήτηση δεσμών συγγένειας με υψηλή εξειδίκευση και συγγένεια και με την ανάπτυξη πρωτοκόλλων δοκιμών που ελαχιστοποιούν την CR. Για παράδειγμα, από καιρό χρησιμοποιούνται συνδετικοί παράγοντες με χαμηλές σταθερές διάσπασης (και χαμηλούς ρυθμούς αποδέσμευσης), επειδή μπορούν να αντέξουν τα σκληρά στάδια πλύσης σε ELISA και άλλες δοκιμασίες, ενώ τα ασθενώς δεσμευμένα και διασταυρούμενα είδη ξεπλένονται [4]".
"Στην ευνοϊκότερη περίπτωση, η CR συμβάλλει στην αύξηση του θορύβου υποβάθρου, θέτοντας σε κίνδυνο το LOD της ανάλυσης, αλλά στη χειρότερη περίπτωση δημιουργεί ψευδώς θετικό σήμα. Η ευπάθεια εκφράζεται επίσης από το γεγονός ότι ένα μόνο μολυσμένο dAb ή ένα πρόσθετο στο μείγμα μπορεί να θέσει σε κίνδυνο όλες τις αναλύσεις, καθώς αλληλεπιδρά με ολόκληρη τη συστοιχία. Ορίζουμε την CR που προκύπτει λόγω της ανάμιξης αντιδραστηρίων ως CR με βάση τα αντιδραστήρια".
"Οι τελικοί χρήστες των εμπορικών MSA διεξήγαγαν πολυάριθμες μελέτες αξιολόγησης των επιδόσεων των διαφόρων κιτ και οι αρχικές μελέτες με περιορισμένη πολυπλεξία διαπίστωσαν καλές συσχετίσεις και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι MSA είναι αναπαραγώγιμες [22]. Πιο πρόσφατα, μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό στόχων και πιο κριτική ανάλυση διαπίστωσαν έλλειψη αναπαραγωγιμότητας και συσχέτισης μεταξύ κιτ από τον ίδιο [20] και από διαφορετικούς προμηθευτές [23-26]. Επιπλέον, μια μελέτη διαπίστωσε σημαντικές διαφορές ανάλογα με το αν μια δοκιμασία εκτελέστηκε σε μορφή single-plex ή σε μορφή multiplex, υποδεικνύοντας ότι οι MSA ενδέχεται να μην είναι ακριβείς [27]. Λόγω αυτών των ευρημάτων και πρόσθετων προβλημάτων [28-], η χρήση των MSA με ανάμιξη αντιδραστηρίων συχνά δεν συνιστάται για ποσοτικές αναλύσεις και κλινικές μελέτες [20,23-27,28-]. Οι συγγραφείς αυτών των μελετών φαίνεται ότι δεν γνωρίζουν την ευπάθεια στην ΚΚ με αντιδραστήριο, γεγονός που θα μπορούσε να εξηγήσει την παρατηρούμενη μεταβλητότητα και τα αντιφατικά συμπεράσματα".
Συζήτηση
"Η CR είναι δύσκολο να εξαλειφθεί από τους ανοσοδοκιμασίες, καθώς οι Abs είναι ατελείς και συχνά ένα "μαύρο κουτί", ωστόσο αναζητούνται δοκιμασίες με όλο και μεγαλύτερη πολυπλεξία και υψηλότερες ευαισθησίες. Μεγάλο μέρος της συζήτησης στην παρούσα γνωμοδότηση βασίζεται σε τυχαίες παρατηρήσεις της CR και σε συλλογισμούς. Πράγματι, οι συστηματικές μελέτες της CR είναι σπάνιες [5,18-] και η πηγή της CR ή της παρεμβολής της ανάλυσης είναι δύσκολο να εντοπιστεί".
doi: 10.1016/j.cbpa.2013.11.012
Αυτή η τελική μελέτη είναι από τον Αύγουστο του 2020. Την συμπεριέλαβα για να δείξω ότι 15 χρόνια μετά την έκκληση του Saper προς την επιστημονική κοινότητα, οι κατευθυντήριες γραμμές του εξακολουθούν να μην ακολουθούνται, καθώς η ακρίβεια και η επικύρωση των αντισωμάτων εξακολουθεί να είναι αμφισβητούμενης φύσης χωρίς τυποποιημένες κατευθυντήριες γραμμές για την επικύρωσή τους. Υπολογίζεται μάλιστα ότι μόνο το 52% των εργαστηρίων υιοθέτησε κάποιες ή όλες τις εργαστηριακές κατευθυντήριες γραμμές που είχαν τεθεί από έναν άλλο ερευνητή το 2014. Χωρίς έναν κεντρικό φορέα που να πιστοποιεί τα αποτελέσματα, πέφτει πάνω στο ελαττωματικό σύστημα αξιολόγησης από ομοτίμους για να διατηρηθεί η επιστημονική βιβλιογραφία "ακριβής". Η έλλειψη επαλήθευσης του κατά πόσον τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στοχεύουν πράγματι τον επιθυμητό παράγοντα είναι ο κινητήριος παράγοντας πίσω από την τρέχουσα κρίση αναπαραγωγιμότητας στην έρευνα που βασίζεται σε αυτά τα θεωρητικά σωματίδια:
Επικύρωση αντισωμάτων για την έκφραση πρωτεϊνών σε αντικειμενοφόρους πλάκες ιστών: ένα πρωτόκολλο ανοσοϊστοχημείας
"Τα αντισώματα διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη βασική έρευνα και στη λήψη κλινικών αποφάσεων. Ωστόσο, δεν υπάρχουν τυποποιημένοι αλγόριθμοι ή κατευθυντήριες γραμμές που να διασφαλίζουν την ακρίβεια και την εγκυρότητά τους. Έχουν γίνει προσπάθειες για τη δημιουργία συναίνεσης, αλλά, με εξαίρεση τα κλινικά εργαστήρια, η επικύρωση αντισωμάτων παραμένει μεταβλητή στη βιβλιογραφία και μερικές φορές στην κλινική πρακτική. Εδώ εστιάζουμε στην ανοσοϊστοχημεία, ένα παράδειγμα επιστημονικού και κλινικού εργαλείου όπου η επικύρωση των αντισωμάτων είναι κρίσιμη. Περιγράφουμε ένα πρωτόκολλο που χρησιμοποιούμε για την επικύρωση αντισωμάτων ειδικά για την ανοσοϊστοχημεία, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων από τους πυλώνες της επικύρωσης αντισωμάτων από τους Uhlen et al. 2016, ως παράδειγμα μιας αυστηρής προσέγγισης για τη δημιουργία δοκιμών με βάση τα αντισώματα τόσο για τα εργαστήρια βασικών και μεταφραστικών επιστημών όσο και για την κλινική".
"Τα δεδομένα από τον Άτλαντα Ανθρώπινων Πρωτεϊνών δείχνουν ότι τουλάχιστον το 50 % από τα πάνω από 2.500 εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα δεν είχαν την αναμενόμενη απόδοση στην προβλεπόμενη δοκιμασία τους [2]. Ακατάλληλα επικυρωμένα αντισώματα, όπως αρκετά που στοχεύουν στον υποδοχέα β των οιστρογόνων, έχουν οδηγήσει σε μη ορθολογική έρευνα σε πολλά υποσχόμενα πεδία".
"Ο FDA ορίζει την επικύρωση ως "τη συλλογή και αξιολόγηση δεδομένων, από το στάδιο του σχεδιασμού της διεργασίας έως την εμπορική παραγωγή, η οποία τεκμηριώνει επιστημονικά ότι μια διεργασία είναι ικανή να παράγει σταθερά ποιοτικό προϊόν". Το 2014, οι Fitzgibbons et al. ανέπτυξαν κατευθυντήριες γραμμές εργαστηριακής πρακτικής για την αναλυτική επικύρωση και επανεπικύρωση των δοκιμασιών IHC που χρησιμοποιούνται σε κλινικές υπηρεσίες ανατομικής παθολογίας [6]. Παρόλα αυτά, εκτιμάται ότι μόνο το 52% των εργαστηρίων έχουν υιοθετήσει ορισμένες ή όλες τις συστάσεις [7]. Οι Sfanos et al. εξήγησαν ότι ένα μεγάλο μέρος της "κρίσης αναπαραγωγιμότητας" που σχετίζεται με τη χρήση αντισωμάτων στην IHC οφείλεται στο γεγονός ότι οι τελικοί χρήστες δεν γνωρίζουν την ανάγκη κατάλληλης επικύρωσης ενός αντισώματος [8]".
"Για χρήση σε δοκιμασία IHC, ένα αντίσωμα πρέπει να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο και επίσης ιδιαίτερα ειδικό για το αντιγόνο-στόχο. Τα καλύτερα αντισώματα έχουν πολύ υψηλή συγγένεια και πολύ χαμηλή διασταυρούμενη αντιδραστικότητα. Είναι επίσης ευεργετικό να έχουν γρήγορο ρυθμό ενεργοποίησης και αργό ρυθμό απενεργοποίησης. Ωστόσο, ακόμη και με ανασυνδυασμένες μεθόδους, είναι δύσκολο και δαπανηρό να κατασκευαστεί ένα τέλειο αντίσωμα, ιδίως για χρήση σε IHC- οι εν λόγω δοκιμασίες απαιτούν ιδίως μοναδικές συνθήκες για τα αντιγόνα, καθώς η σταθεροποίηση των ιστών μπορεί να αποκρύψει επιτόπους που εκτίθενται σε εγγενείς ή μετουσιωμένες μορφές και να εκθέσει επιτόπους που δεν εκτίθενται όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται στην εγγενή της μορφή in vivo [10,11].
Για μακροχρόνια χρήση σε μια διαγνωστική δοκιμή, ακόμη και για αναπαραγώγιμες επιστημονικές μελέτες, τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι η καλύτερη επιλογή. Τα πολυκλωνικά αντισώματα παράγονται από διάφορους κλώνους Β-κυττάρων και ουσιαστικά αντιπροσωπεύουν μια ομάδα διαφορετικών κλώνων αντισωμάτων, καθένας από τους οποίους συνδέεται με έναν ξεχωριστό επίτοπο στο αντιγόνο-στόχο. Παρόλο που μπορεί να είναι καλά για γρήγορες μελέτες απόδειξης της έννοιας, αντιπροσωπεύουν ένα μίγμα συγκεκριμένης παρτίδας που τελικά θα εξαντληθεί και είναι στη συνέχεια αδύνατο να αναπαραχθεί επακριβώς. Τα μονοκλωνικά αντισώματα παράγονται από πανομοιότυπους κλώνους κυττάρων Β από ένα μόνο γονικό κύτταρο και δεσμεύονται σε έναν μόνο, καθορισμένο επίτοπο στο αντιγόνο-στόχο- έτσι είναι εξαιρετικά ειδικά και συνεπή μεταξύ των πειραμάτων. Επιπλέον, με τις ανασυνδυασμένες τεχνολογίες, μπορούν να βελτιστοποιηθούν και να αναπαραχθούν με ακρίβεια. Ως εκ τούτου, για επιστημονικά αυστηρές εργασίες ή για κλινικά χρήσιμες διαγνωστικές δοκιμασίες, απαιτείται ένα μονοκλωνικό αντίσωμα. Ωστόσο, όπως έχει αποδειχθεί, τα μονοκλωνικά αντισώματα που απευθύνονται σε έναν στόχο δεν είναι όλα απαλλαγμένα από τα δικά τους προβλήματα εξειδίκευσης και αναπαραγωγιμότητας και πρέπει να δίνεται προσοχή στην επιλογή του καλύτερου μονοκλωνικού αντισώματος, το οποίο πρέπει πάντα να επικυρώνεται πριν από τη χρήση [12,13]”.
"Πηγαίνοντας ακόμη παραπέρα, έχει προταθεί ότι, επειδή η ειδική αλληλουχία για κάθε αντίσωμα μπορεί να καθοριστεί και να αναφερθεί, η αποκάλυψη της αλληλουχίας του επιτόπου θα επέτρεπε την αδιαμφισβήτητη γνώση του χρησιμοποιούμενου αντισώματος [42]. Ορισμένοι συγγραφείς σημειώνουν ότι ένα πλεονέκτημα των προσεγγίσεων ανασυνδυασμένων αντισωμάτων είναι ότι οι αλληλουχίες θα μπορούσαν να αναφερθούν ευκολότερα και θα απλοποιούσαν τις προσπάθειες επικύρωσης [36,43]. Ενώ η αναφορά των αλληλουχιών φαίνεται καλή ιδέα από επιστημονική άποψη, πολλοί εμπορικοί πωλητές επισημαίνουν ότι ο επίτοπος είναι η "μυστική σάλτσα" που κάνει το αντίσωμά τους καλύτερο από τους άλλους ανταγωνιστές. Αντί να προσπαθήσουν να κατοχυρώσουν με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας κάθε επίτοπο (κάτι που δεν είναι οικονομικά εφικτό), διατηρούν εμπιστευτικότητα σχετικά με τον επίτοπό τους και την αλληλουχία του [44].”
"Επειδή τα ερευνητικά εργαστήρια στον ακαδημαϊκό τομέα δεν υπόκεινται σε καμία πιστοποίηση και η αξιολόγηση από ομότιμους είναι το μόνο "ρυθμιστικό όργανο" σε αυτόν τον τομέα, είναι ίσως μη ρεαλιστικό να περιμένουμε αυστηρή τήρηση οποιωνδήποτε απαιτήσεων τυποποίησης".
"Μια άλλη βασική έννοια που ενδέχεται να είναι σημαντική στην IHC στο μέλλον είναι η βιοχημεία αντισωμάτων. Σε γενικές γραμμές, οι σταθερές συγγένειας και διάστασης για τα περισσότερα μονοκλωνικά αντισώματα δεν είναι γνωστές ή δεν είναι εύκολα διαθέσιμες. Τα βέλτιστα αντισώματα για IHC έχουν γρήγορο ρυθμό ενεργοποίησης και αργό ρυθμό απενεργοποίησης, αλλά η κινητική της δέσμευσης αντισωμάτων για IHC ουσιαστικά δεν δημοσιεύεται ποτέ".
https://www.future-science.com/doi/10.2144/btn-2020-0095
Συνοψίζοντας:
Σύμφωνα με τον ειδικό σε θέματα αντισωμάτων Clifford Saper: "Όχι, δεν υπάρχει τέτοιο πράγμα όπως ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που, επειδή είναι μονοκλωνικό, αναγνωρίζει μόνο μια πρωτεΐνη ή μόνο έναν ιό. Θα συνδεθεί με οποιαδήποτε πρωτεΐνη που έχει την ίδια (ή μια πολύ παρόμοια) αλληλουχία".
Ένα άρθρο του 2015 που αναδεικνύει τον Saper ανέφερε ότι τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην έρευνα συχνά δίνουν θολά αποτελέσματα
Ένα ποντίκι προειδοποίησε για πρώτη φορά τον Clifford Saper για το γεγονός ότι τα αντισώματα παραπλανούσαν την επιστημονική κοινότητα
Τα αποτελέσματα που χρησιμοποιούσαν ποντίκια νοκ-άουτ ήταν ανησυχητικά, καθώς η χρώση αντισωμάτων σε ζώα νοκ-άουτ θα έπρεπε να δείχνει ριζικά διαφορετικά μοτίβα από εκείνα σε μη τροποποιημένα ζώα, αλλά πολύ συχνά οι εικόνες ήταν πανομοιότυπες
Λόγω των πολυάριθμων ανακλήσεων, ο Saper και οι συνάδελφοί του στη σύνταξη καθιέρωσαν μια πολιτική που απαιτούσε εκτεταμένα δεδομένα επικύρωσης για κάθε αντίσωμα
Η πολιτική αυτή ήταν καλή για την αυστηρότητα, αλλά όχι για τις υποβολές, καθώς πολλοί ερευνητές έψαχναν αλλού για να δημοσιεύσουν τα αποτελέσματα
Οι ερευνητές της βιοϊατρικής εξακολουθούν να συλλέγουν ιστορίες θλίψης για τα αντισώματα
Η πιο συνηθισμένη γκρίνια είναι το αντιδραστήριο που εξαπατά: το αντίσωμα που αγοράστηκε για να ανιχνεύσει την πρωτεΐνη Χ δεσμεύει κρυφά την πρωτεΐνη Υ (και ίσως αγνοεί εντελώς την Χ)
Ένα άλλο παράπονο είναι ο "χαμένος θησαυρός": μια σειρά από πολλά υποσχόμενα πειράματα που σταματούν όταν μια νέα παρτίδα αντισωμάτων αποτυγχάνει να αναπαράγει τα προηγούμενα ευρήματα
Είναι ανησυχητική η ανακάλυψη ότι τα αντισώματα μπορεί να είναι αναξιόπιστα αντιδραστήρια
Η ανεπαρκής εξειδίκευση, ευαισθησία και συνοχή μεταξύ των παρτίδων έχουν οδηγήσει σε ψευδή ευρήματα και άσκοπες προσπάθειες.
Η αναξιοπιστία των αντισωμάτων έχει προκαλέσει το τίμημά της σε όλες τις μελέτες σε:
Καρκίνος
Μεταβολισμός
Γήρανση
Ανοσολογία και κυτταρική σηματοδότηση
Οποιοδήποτε πεδίο αφορά την έρευνα πολύπλοκων βιομορίων.
Οι απώλειες από την αγορά ανεπαρκώς χαρακτηρισμένων αντισωμάτων υπολογίζονται σε 800 εκατ. δολάρια ετησίως, χωρίς να υπολογίζονται οι επιπτώσεις των λανθασμένων συμπερασμάτων, των μη ερμηνεύσιμων (ή παρερμηνευμένων) πειραμάτων, των χαμένων δειγμάτων ασθενών και του άσκοπου ερευνητικού χρόνου.
Σε μια ανοικτή επιστολή που έγραψε ο Saper στο The Journal of Comparative Neurology το 2005, ανέφερε ότι η χρήση της ανοσοϊστοχημείας και η απασχόληση μιας μπαταρίας δέκα ή περισσότερων αντισωμάτων για την εξέταση θεμάτων συγκόλλησης ή κυτταρικής τυποποίησης έχει οδηγήσει σε μια πλημμύρα παραπληροφόρησης
Το περιοδικό έλαβε πολυάριθμες θλιμμένες ανακοινώσεις από συγγραφείς που αναγκάστηκαν να αποσύρουν εργασίες επειδή ένα αντίσωμα έναντι ενός νέου δείκτη βρέθηκε να χρωματίζει ιστό σε ζώα knockout, τα οποία στερούνται την εν λόγω πρωτεΐνη-στόχο
Σε πολλές περιπτώσεις, οι εργασίες αυτές περιείχαν προσεκτικό χαρακτηρισμό των αντισωμάτων και ανοσοκυτταροχημικούς ελέγχους
Οι συντάκτες θεώρησαν ότι η ακεραιότητα της επιστημονικής επικοινωνίας απειλείται από τον πολλαπλασιασμό των ανεπαρκώς χαρακτηρισμένων αντισωμάτων που παράγουν τεχνητά πρότυπα χρώσης
Υπήρχε σύγχυση σχετικά με το πώς μπορεί να εξασφαλιστεί ένα εύλογο επίπεδο βεβαιότητας ότι ένα αντίσωμα αναγνωρίζει πράγματι αυτό που υποτίθεται ότι χρωματίζει.
Αποφάσισαν ότι χρειάζονται τρία βασικά κριτήρια για την περιγραφή των αντισωμάτων σε έγγραφα
Πλήρεις πληροφορίες για το αντίσωμα.
⃝ Είναι σημαντικό να αναγνωριστεί ότι τα αντισώματα δεν είναι απλά αντιδραστήρια που αναγνωρίζουν πάντα το ίδιο πράγμα
⃝ Αναγνώριση: Ποια ήταν η πηγή του αντισώματος;
⃝ Προετοιμασία του αντισώματος: Τι ήταν αυτό το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε στην πραγματικότητα;
⃝ Ορισμένοι κατασκευαστές αντισωμάτων προσπαθούν σκόπιμα να αποκρύψουν τις πληροφορίες σχετικά με τη δομή του αντιγόνου
⃝ Έλαβαν παράπονα από συγγραφείς ότι αρκετοί κατασκευαστές ισχυρίστηκαν ότι οι πληροφορίες για την αλληλουχία του αντιγόνου ήταν "ιδιοκτησία" και δεν τις παρείχαν
⃝ Επειδή οι εργασίες που χρησιμοποιούν αυτά τα αντισώματα είναι εγγενώς μη επαναλήψιμες, τέτοιες εργασίες δεν είναι αποδεκτές για δημοσίευση
2. Πώς έχει χαρακτηριστεί η ειδικότητα του αντισώματος;
⃝ Ιδανικά, ένα αντίσωμα θα πρέπει να χρωματίζει μία μόνο ζώνη (ή πολλές ζώνες εάν το αντιγόνο έχει πολλές γνωστές μοριακές διαμορφώσεις) κατάλληλου μοριακού βάρους
⃝ Δεν αρκεί η απλή αναφορά "αυτός ο αντιορός έχει χαρακτηριστεί προηγουμένως (Jones et al., 2002)".
3. Ποιοι έλεγχοι είναι απαραίτητοι για την ανοσοχρώση;
⃝ Εκπλήσσονται διαρκώς από την περίεργη εμπιστοσύνη πολλών συναδέλφων τους, οι οποίοι φαίνεται να πιστεύουν (ή να θέλουν να πιστεύουν) ότι ένα αντίσωμα θα χρωματίσει αυτό που ισχυρίζεται ο κατασκευαστής, αλλά, σε πολλές περιπτώσεις, τίποτα δεν θα μπορούσε να απέχει περισσότερο από την αλήθεια.
⃝ Ο χρυσός κανόνας από αυτή την άποψη είναι: το αντίσωμα χρωματίζει τον ιστό ενδιαφέροντος από τον οποίο έχει αφαιρεθεί το μόριο ενδιαφέροντος;
⃝ Αυτό ισχύει μόνο εάν εξετάζετε ιστό από ζώο για το οποίο υπάρχει knockout
⃝ Ο Saper παραδέχεται ότι οι περισσότεροι από αυτούς, τις περισσότερες φορές, πρέπει να αρκεστούν σε μικρότερους βαθμούς βεβαιότητας
⃝ Αυτό δεν προστατεύει από άλλες πρωτεΐνες ιστών που μπορεί να διασταυρωθούν και είχαν μια σειρά από εργασίες που τελικά αποσύρθηκαν όταν ένα αντι-ορό που πέρασε το τεστ προαπορρόφησης αποδείχτηκε επίσης ότι χρωμάτισε ιστό από ζώα με νοκ-άουτ.
⃝ Η στρατηγική αυτή δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία πάντα θα προσροφώνται από το αντιγόνο τους, ακόμη και αν χρωματίζουν κάτι εντελώς διαφορετικό στον ιστό.
⃝ Σημειώνει ότι οι έλεγχοι παράλειψης (χρώση χωρίς το πρωτογενές αντίσωμα) ΔΕΝ είναι καθόλου έλεγχοι για την ειδικότητα του πρωτογενούς αντισώματος
Ο Saper καταλήγει στο συμπέρασμα ότι είναι ζωτικής σημασίας για κάθε αντίσωμα που χρησιμοποιείται, οι συγγραφείς πρέπει να παρέχουν επαρκείς πληροφορίες ώστε να διασφαλίζεται ότι το αποτέλεσμα είναι αναπαραγώγιμο και πιθανότατα σωστό
Η τυφλή πίστη ότι το αντίσωμα θα βάψει ό,τι ισχυρίζεται ο κατασκευαστής δεν συνάδει με την καλή επιστήμη.
Πολλοί ερευνητές δεν γνωρίζουν τα πιθανά προβλήματα με την ειδικότητα των αντισωμάτων και την ανάγκη να τεκμηριώνεται σχολαστικά ο χαρακτηρισμός του αντισώματος για κάθε αντίσωμα που χρησιμοποιείται.
Η ανοσοϊστοχημική χρώση έχει γίνει τόσο καθημερινή που συχνά θεωρείται ότι η IHC έχει ανάλογη ικανότητα να προσδιορίζει με ακρίβεια τους μοριακούς στόχους, αλλά τίποτα δεν θα μπορούσε να απέχει περισσότερο από την αλήθεια
Οι μέθοδοι IHC παραμένουν πρωτόγονες όσον αφορά τόσο την ευαισθησία όσο και την ειδικότητα.
Οι θεμελιώδεις αρχές στις οποίες βασίζεται ο εντοπισμός των αντισωμάτων δεν έχουν βελτιωθεί καθόλου τις τελευταίες δύο δεκαετίες και, αν μη τι άλλο, ο κατήφορος που καταλαμβάνει η IHC έχει γίνει πιο ολισθηρός από ποτέ
Στα μονοκλωνικά αντισώματα (εργαστηριακές πρωτεΐνες που παρασκευάζονται από καρκινικά κύτταρα και μιμούνται την ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να καταπολεμά επιβλαβή παθογόνα, όπως οι "ιοί"), είναι πιθανό η μεταβλητή περιοχή να συνδέεται με μια ποικιλία διαφορετικών στόχων και αυτοί να είναι αρκετά διαφορετικοί από το μόριο κατά του οποίου έχει εκτραφεί το αντίσωμα
Τα μονοκλωνικά αντισώματα προέρχονται από κύτταρα υβριδώματος (υβριδικά κύτταρα που παράγονται από τη σύντηξη ενός λεμφοκυττάρου που παράγει αντισώματα με ένα καρκινικό κύτταρο) τα οποία αναπτύσσονται είτε σε καλλιέργεια είτε με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση σε ένα ζώο ξενιστή.
Είτε το υγρό καλλιέργειας είτε το ασκιτικό υγρό από ζώα που περιέχουν τα αντισώματα μπορεί να υποβληθεί σε καθαρισμό με καθίζηση των αντισωμάτων με πρωτεΐνη Α και τα προκύπτοντα σχετικά καθαρά παρασκευάσματα αντισωμάτων (δηλαδή όχι καθαρά) ποσοτικοποιούνται με βάση τα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης
Οι πολυκλωνικοί αντιοροί, αντίθετα, προέρχονται από την αιμορραγία των ζώων μερικές εβδομάδες μετά την ανοσοποίησή τους και συνήθως χορηγούνται αρκετές "αναμνηστικές ανοσοποιήσεις" με αρκετές αιμορραγίες που λαμβάνονται
Κατά την ενίσχυση του ίδιου ζώου με επανειλημμένες ανοσοποιήσεις με το ίδιο αντιγόνο, η περιεκτικότητα σε αντισώματα σε διαδοχικές αιμορραγίες μπορεί να διαφέρει σημαντικά
Η παρτίδα για έναν πολυκλωνικό αντιορό είναι κρίσιμη, και ακόμη και μια άλλη παρτίδα από το ίδιο ζώο μπορεί να έχει εντελώς διαφορετικές ιδιότητες χρώσης
Η δυνατότητα δημιουργίας συνθετικών πρωτεϊνών και πεπτιδίων έχει φέρει "επανάσταση" στον τρόπο με τον οποίο μπορούν να παραχθούν αντισώματα και στον τρόπο με τον οποίο μπορούν να χαρακτηριστούν
Όταν το αντίσωμα δεσμεύεται σε μια μερική αλληλουχία ή μια μερική αλληλουχία ανταγωνίζεται τη δέσμευση στο εγγενές μόριο, ο επίτοπος ή τα δομικά χαρακτηριστικά που αναγνωρίζει το αντίσωμα θεωρείται (δηλαδή υποθέτουμε ότι κάτι συμβαίνει βάσει πιθανότητας) ότι βρίσκεται σε αυτή την αλληλουχία
Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για να χαρτογραφηθεί ο επίτοπος που δεσμεύει το αντίσωμα, ωστόσο, αυτό δεν υποδεικνύει ποια ήταν η αλληλουχία του αρχικού ανοσογόνου, διότι το αντίσωμα μπορεί να έχει παραχθεί έναντι μιας αλληλουχίας που επικαλύπτεται
Όταν τα δύο διαφορετικά αντισώματα χρωματίζουν ακριβώς το ίδιο μοτίβο, είναι πολύ πιθανό (δηλ. όχι 100% βέβαιο) ότι χρωματίζουν τον σωστό στόχο.
Τα ειδικά τροποποιημένα συνθετικά αντισώματα που παρασκευάζονται με αυτόν τον τρόπο μπορεί να είναι σε θέση να διακρίνουν μεταξύ διαφορετικών τροποποιημένων μορφών του ίδιου μορίου με μεγάλη ακρίβεια
Οι περισσότεροι ερευνητές θέλουν να χρησιµοποιούν αντισώµατα για τον εντοπισµό κυτταρικών συστατικών και δεν θέλουν να γίνουν ειδικοί στην ανοσολογία ή στην IHC για να το επιτύχουν.
Ο Saper δηλώνει ότι είναι χρήσιμο να υπάρχει ένα σύνολο κριτηρίων για το τι συνιστά εύλογο βαθμό βεβαιότητας ότι το αντίσωμα που χρησιμοποιείται στοχεύει πράγματι το σωστό αντιγόνο.
Εάν όλοι οι ερευνητές ακολουθούσαν τους κανόνες, η βιβλιογραφία θα ήταν πολύ πιο ακριβής
Τα ερωτήματα που πρέπει να τεθούν είναι τα εξής:
1. Ποιο ανοσογόνο χρησιμοποιείται για την αύξηση του αντισώματος;
⃝ Μια βασική αρχή της επιστήμης είναι ότι η εργασία πρέπει να είναι επαναλήψιμη
⃝ Εάν το αντίσωμα έχει εκτραφεί έναντι ενός "ιδιόκτητου" αντιγόνου (συνήθως μια μυστική αλληλουχία αμινοξέων, για να αποφευχθεί η αντιγραφή του προϊόντος από τους ανταγωνιστές), απλά δεν είναι έγκυρο για σοβαρή επιστημονική εργασία
2. Ποια είναι τα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το αντίσωμα δεσμεύεται ειδικά στο αναμενόμενο μόριο-στόχο στον ιστό ενδιαφέροντος;
⃝ Οι ερευνητές θα πρέπει να αποκτήσουν τουλάχιστον εύλογες αποδείξεις ότι το αντίσωμα όντως συνδέεται με τον αναμενόμενο στόχο του στον ιστό στον οποίο θα μελετηθεί και όχι με κάτι άλλο
⃝ Εάν χρωματιστούν ξένες ζώνες, αυτό υποδηλώνει ότι το αντίσωμα έχει άλλους πρόσθετους στόχους στον ιστό και θα πρέπει να εγείρει κόκκινες σημαίες κατά της χρήσης του εν λόγω αντισώματος για IHC.
⃝ Είναι πολύ πιθανό το αντίσωμα να δει μόνο μία ζώνη σε ορισμένους ιστούς αλλά να δει πολλαπλές ξένες ζώνες σε άλλους ιστούς από το ίδιο ζώο.
⃝ Παρομοίως, οι κατασκευαστές συχνά προσπαθούν να "αποδείξουν" την ειδικότητα με την εκτέλεση του αντισώματος έναντι ενός παρασκευάσματος πηκτώματος καθαρισμένης ή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, το οποίο μπορεί να δείξει ότι το αντίσωμα μπορεί να συνδεθεί στο στόχο του, αλλά δεν λέει τίποτα για το με τι άλλο μπορεί να συνδεθεί στον ιστό.
3. Ποιοι έλεγχοι μπορούν να γίνουν για να διασφαλιστεί ότι το αντίσωμα συνδέεται σε σταθερό ιστό μόνο με το μόριο-στόχο του;
⃝ Σε σταθεροποιημένη κατάσταση, είναι πιθανό το αντίσωμα που λειτουργεί καλά σε ένα Western blot να διαπιστώσει ότι το αντιγόνο-στόχος του έχει παραμορφωθεί από τη διαδικασία σταθεροποίησης και δεν είναι πλέον αναγνωρίσιμο
⃝ Όταν οι πολυκλωνικοί αντιοροί εκτρέφονται έναντι ενός πεπτιδικού αντιγόνου, είναι σύνηθες οι περισσότεροι από τους αντιορούς που παράγονται να χρωματίζουν τον σταθεροποιημένο ιστό ανεπαρκώς ή καθόλου
⃝ Ένας από τους καλύτερους ελέγχους είναι η μεταμόσχευση του DNA για την πρωτεΐνη-στόχο σε κύτταρα που κανονικά δεν την παράγουν στην καλλιέργεια ιστών, ωστόσο, αυτός ο έλεγχος δεν αποδεικνύει ότι το αντίσωμα θα χρωματίσει τον στόχο του μόνο στον ιστό ενδιαφέροντος
⃝ Ένας άλλος έλεγχος για την ειδική χρώση στον ιστό είναι η δοκιμασία προαπορρόφησης, η οποία περιλαμβάνει την ανάμειξη του αραιωμένου αντισώματος με περίσσεια ανοσογόνου που θα πρέπει να εμποδίζει πλήρως τη χρώση.
⃝ Αυτό δείχνει ότι η χρώση στον ιστό γίνεται έναντι κάτι που είναι τουλάχιστον διασταυρούμενα αντιδραστικό με την αρχική πρωτεΐνη (αν και δεν αποδεικνύει ότι αυτός είναι ο πραγματικός στόχος στον ιστό).
⃝ Ο έλεγχος προαπορρόφησης δεν έχει νόημα για ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (το οποίο παράγεται με διαλογή για τη σύνδεσή του με τον στόχο και, επομένως, θα τον δεσμεύει πάντα και θα περνάει πάντα τον έλεγχο προαπορρόφησης, εξ ορισμού) και για αντισώματα που έχουν ήδη καθαριστεί με συγγένεια (για τον ίδιο λόγο).
⃝ Η απουσία χρώσης αποτελεί ισχυρή επιβεβαίωση της ειδικότητας, αλλά δυστυχώς αυτό δεν είναι ένα τέλειο τεστ, διότι ο στόχος που χρωματίζεται στον ιστό μπορεί να είναι ένα συγγενικό μόριο που είναι υπορυθμισμένο στο ζώο νοκ-άουτ
⃝ Επιπλέον, η προσέγγιση αυτή εφαρμόζεται μόνο σε περιπτώσεις όπου υπάρχει διαθέσιμη στρατηγική knockout, γεγονός που την περιορίζει σε λίγα είδη-μοντέλα
⃝ Τέλος, σε πολλά λεγόμενα knockout ποντίκια, η αρχική πρωτεΐνη δεν εξαλείφεται εντελώς και εάν εξακολουθεί να εκφράζεται μόνο ένα τμήμα της πρωτεΐνης αυτής, μπορεί να μην έχει λειτουργική παρουσία αλλά να εξακολουθεί να χρωματίζεται με το αντίσωμα
⃝ Όταν δύο αντισώματα παρασκευάζονται στο ίδιο είδος, η επίδειξη ότι τα σχέδια χρώσης είναι πολύ παρόμοια (δηλαδή όχι πανομοιότυπα) αποτελεί ισχυρό έλεγχο.
Ο Saper καταλήγει στο συμπέρασμα ότι πάντα ανακαλύπτουμε νέους τρόπους με τους οποίους η φύση μπορεί να μας ξεγελάσει και συνεπώς, κανένας εντοπισμός αντισώματος δεν είναι πραγματικά τέλειος
Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα (CR) σε ανοσοδοκιμασίες πολλαπλών αναλύσεων ήταν απροσδόκητα δύσκολο να μετριαστεί, εμποδίζοντας την κλιμάκωση της πολυπλεξίας, περιορίζοντας την απόδοση της ανάλυσης και οδηγώντας σε ανακριβή ή ακόμη και ψευδή αποτελέσματα και λανθασμένα συμπεράσματα.
Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα (CR) σε πρωτεΐνες που δεν αποτελούν στόχο είναι πανταχού παρούσα και ευρέως διαδεδομένη για τα αντισώματα και μαζί με την έλλειψη Abs έναντι πολλών στόχων, αποτελεί αναμφισβήτητα το μεγαλύτερο εμπόδιο στην καθιέρωση ανοσοδοκιμών υψηλής απόδοσης και μεγάλης κλίμακας πολυπλεξίας
Εάν η CR δεν αντιμετωπιστεί επαρκώς και δεν κατασταλεί, ή τουλάχιστον δεν μετριαστεί, μπορεί να είναι καταστροφική για την απόδοση και την αξιοπιστία των ανοσολογικών δοκιμών.
Διαπιστώθηκε ότι η CR σε μη ομόλογες αλληλουχίες αμινοξέων είναι ευρέως διαδεδομένη
Το Human Protein Atlas δημιούργησε έναν πολυκλωνικό αγωγό παραγωγής Ab με αυστηρά πρότυπα ποιοτικού ελέγχου και, σε μια ηράκλεια προσπάθεια, παρήγαγε Abs έναντι 15.000 από τις 20.000 ανθρώπινες πρωτεΐνες (Human Protein Atlas- URL: http://www.proteinatlas.org/).
Ωστόσο, όταν οι Schwenk et al. αξιολόγησαν μια προεπιλογή 11.000 μονοειδικών Abs που καθαρίστηκαν με συγγένεια, μόνο 531 Abs παρήγαγαν μια ενιαία ζώνη σε μια κηλίδα Western, υποδεικνύοντας ότι το 95% δεσμεύεται σε πρωτεΐνες εκτός της αναμενόμενης ζώνης.
Συλλογικά, οι μελέτες αυτές υπογραμμίζουν ότι οι συνδετικοί παράγοντες συγγένειας συχνά διασταυρώνονται
Η CR και η μη ειδική δέσμευση έχουν μελετηθεί εκτενώς για δοκιμασίες μονής πολλαπλότητας και ίσως να μην είναι δυνατόν να εξαλειφθούν εντελώς
Απαιτούνται δύο ταυτόχρονες ψευδείς δεσμεύσεις για να οδηγήσουν σε ανιχνεύσιμη CR, αλλά οι πιθανότητες να συμβεί αυτό είναι πολύ χαμηλές
Το σημείο αυτό υπογραμμίζει τη σημασία της διάκρισης μεταξύ της CR που οδηγεί σε ψευδώς θετικά σήματα και της CR που δεν οδηγεί σε σήμα και η οποία μπορεί να γίνει ανεκτή (γιατί να γίνει ανεκτή η CR ;), αλλά δεν πρέπει να αγνοηθεί.
Στην πιο ευνοϊκή περίπτωση, η CR συμβάλλει στην αύξηση του θορύβου υποβάθρου, θέτοντας σε κίνδυνο το LOD της ανάλυσης, αλλά στη χειρότερη περίπτωση δημιουργεί ψευδώς θετικό σήμα
Η ευπάθεια εκφράζεται επίσης από το γεγονός ότι ένα μόνο μολυσμένο dAb ή ένα πρόσθετο στο μείγμα μπορεί να θέσει σε κίνδυνο όλες τις αναλύσεις, καθώς αλληλεπιδρά με ολόκληρη τη συστοιχία
Μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό στόχων και πιο κριτική ανάλυση διαπίστωσαν έλλειψη αναπαραγωγιμότητας και συσχέτισης μεταξύ κιτ του ίδιου και διαφορετικών προμηθευτών.
Επιπλέον, μια μελέτη διαπίστωσε σημαντικές διαφορές ανάλογα με το αν μια ανάλυση εκτελέστηκε σε μορφή single-plex ή σε μορφή multiplex, υποδεικνύοντας ότι οι MSA ενδέχεται να μην είναι ακριβείς
Λόγω αυτών των ευρημάτων και πρόσθετων ζητημάτων, η χρήση των MSA με ανάμειξη αντιδραστηρίων συχνά δεν συνιστάται για ποσοτική ανάλυση και κλινικές μελέτες
Οι συγγραφείς αυτών των μελετών φαίνεται να μην γνωρίζουν την ευπάθεια στην CR λόγω αντιδραστηρίων, γεγονός που θα μπορούσε να εξηγήσει την παρατηρούμενη μεταβλητότητα και τα αντιφατικά συμπεράσματα.
Η CR είναι δύσκολο να εξαλειφθεί από τις ανοσοδοκιμές, καθώς τα αντισώματα είναι ατελή και συχνά ένα "μαύρο κουτί".
Οι συστηματικές μελέτες της CR είναι σπάνιες και η πηγή της CR ή της παρεμβολής της ανάλυσης είναι δύσκολο να εντοπιστεί.
Δεν υπάρχουν τυποποιημένοι αλγόριθμοι ή κατευθυντήριες γραμμές για τη διασφάλιση της ακρίβειας και της εγκυρότητας των αντισωμάτων
Έχουν καταβληθεί προσπάθειες για τη δημιουργία συναίνεσης, αλλά, με εξαίρεση τα κλινικά εργαστήρια, η επικύρωση αντισωμάτων παραμένει μεταβλητή στη βιβλιογραφία και μερικές φορές στην κλινική πρακτική
Δεδομένα από τον Άτλαντα Ανθρώπινων Πρωτεϊνών (Human Protein Atlas) δείχνουν ότι τουλάχιστον το 50% από πάνω από 2500 εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα δεν είχαν την αναμενόμενη απόδοση στην προβλεπόμενη δοκιμασία τους
Ο FDA ορίζει την επικύρωση ως "τη συλλογή και αξιολόγηση δεδομένων, από το στάδιο του σχεδιασμού της διαδικασίας έως την εμπορική παραγωγή, η οποία τεκμηριώνει επιστημονικά ότι μια διαδικασία είναι ικανή να παράγει σταθερά ποιοτικό προϊόν".
Οι κατευθυντήριες γραμμές για την ποιότητα θεσπίστηκαν το 2014, ωστόσο εκτιμάται ότι μόνο το 52% των εργαστηρίων έχουν υιοθετήσει ορισμένες ή όλες τις συστάσεις
Οι Sfanos et al. εξήγησαν ότι ένα μεγάλο μέρος της "κρίσης αναπαραγωγιμότητας" που αφορά τη χρήση αντισωμάτων στην IHC οφείλεται στο ότι οι τελικοί χρήστες δεν γνωρίζουν την ανάγκη να επικυρωθεί σωστά ένα αντίσωμα
Τα καλύτερα αντισώματα έχουν πολύ υψηλή συγγένεια και πολύ χαμηλή διασταυρούμενη αντιδραστικότητα
Ακόμη και με ανασυνδυασμένες μεθόδους, είναι δύσκολο και δαπανηρό να παραχθεί ένα τέλειο αντίσωμα, ιδίως για χρήση σε IHC.
Τα πολυκλωνικά αντισώματα μπορεί να είναι καλά για ταχείες μελέτες απόδειξης της έννοιας, αλλά αντιπροσωπεύουν ένα μίγμα συγκεκριμένης παρτίδας που τελικά θα εξαντληθεί και είναι αδύνατο να αναπαραχθεί επακριβώς.
Τα μονοκλωνικά αντισώματα λέγεται ότι είναι τα καλύτερα για μακροχρόνια διαγνωστική χρήση και αναπαραγώγιμες μελέτες, ωστόσο, τα μονοκλωνικά αντισώματα που απευθύνονται σε έναν στόχο δεν στερούνται όλα τα δικά τους ζητήματα εξειδίκευσης και αναπαραγωγιμότητας
Με άλλα λόγια, τα μονοκλωνικά αντισώματα που δημιουργούνται συνθετικά από καρκινικά κύτταρα είναι "καλύτερα" από τα πολυκλωνικά αντισώματα που δημιουργούνται εργαστηριακά από ζωικά κύτταρα αλλά και τα δύο έχουν προβλήματα εξειδίκευσης/αναπαραγωγιμότητας
Η αναφορά των αλληλουχιών έχει προταθεί ως επικύρωση αλλά πολλοί εμπορικοί πωλητές επισημαίνουν ότι ο επίτοπος είναι η "μυστική σάλτσα" που κάνει το αντίσωμά τους καλύτερο από τους άλλους ανταγωνιστές και κρατούν τις αλληλουχίες εμπιστευτικές
Επειδή τα ερευνητικά εργαστήρια στον ακαδημαϊκό τομέα δεν υπόκεινται σε καμία πιστοποίηση και η αξιολόγηση από ομοτίμους είναι το μόνο "ρυθμιστικό όργανο" στον τομέα αυτό, δεν είναι ρεαλιστικό να αναμένεται αυστηρή τήρηση οποιωνδήποτε απαιτήσεων τυποποίησης.
Οι σταθερές συγγένειας και διάστασης για τα περισσότερα μονοκλωνικά αντισώματα δεν είναι γνωστές ή δεν είναι εύκολα διαθέσιμες
Τα βέλτιστα αντισώματα για IHC έχουν γρήγορο ρυθμό ενεργοποίησης και αργό ρυθμό απενεργοποίησης, αλλά η κινητική της σύνδεσης των αντισωμάτων για IHC ουσιαστικά δεν δημοσιεύεται ποτέ.
Εάν τα στοιχεία δείχνουν συνεχώς ότι τα αντισώματα δεν είναι ειδικά, όπως συνήθως ισχυρίζεται η επιστημονική κοινότητα, και ότι διασταυρώνονται με άλλους στόχους, πώς μπορούν να θεωρηθούν έγκυρες οι μετρήσεις που προκύπτουν από τη χρήση τους; Εάν τα πολυκλωνικά αντισώματα είναι τόσο καλά όσο η τρέχουσα παρτίδα και τα αποτελέσματα δεν μπορούν να αναπαραχθούν όταν αυτή εξαντληθεί, ποια αξία έχουν ως ερευνητικό εργαλείο; Εάν τα μονοκλωνικά αντισώματα λέγεται ότι είναι πιο αξιόπιστα, ωστόσο δεν μπορούν να δεσμευτούν σε έναν μόνο "ιό" και στοχεύουν τακτικά άλλες πρωτεΐνες παρόμοιας δομής, πώς μπορούν να εμπιστευθούν τα αποτελέσματα;
Αυτά τα ερωτήματα είναι εύκολο να απαντηθούν μόλις γίνει κατανοητό ότι τα αντισώματα εξακολουθούν να παραμένουν αόρατα θεωρητικά σωματίδια που υποτίθεται ότι υπάρχουν στο σώμα και στα οποία έχουν αποδοθεί αναπόδεικτες μορφές και λειτουργίες για να ταιριάζουν στο καλούπι του επικρατούντος μοντέλου. Δεν υπάρχουν τρόποι με τους οποίους οι ερευνητές μπορούν να δουν άμεσα αυτές τις μικροσκοπικές πρωτεΐνες, οπότε βασίζονται στη χρήση έμμεσων χημικών αντιδράσεων, όπως ανοσοϊστοχημικές χρώσεις, δοκιμές αναστολής της αιμοσυγκόλλησης, δοκιμασίες εξουδετέρωσης, δοκιμές δέσμευσης του συμπληρώματος, δοκιμές ELISA κ.λπ. προκειμένου να ισχυριστούν ότι οι αντιδράσεις που προκύπτουν αποτελούν απόδειξη της ύπαρξης αντισωμάτων. Ισχυρίζονται ότι αυτές οι μετρήσεις έχουν νόημα, ωστόσο όλες αυτές οι μετρήσεις είναι εντελώς άχρηστες και έχουν βρεθεί σταθερά αναξιόπιστες.
Σε αντίθεση με τους δημοφιλείς ισχυρισμούς της επιστημονικής κοινότητας, τα αντισώματα δεν είναι ειδικά. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο μια εξέταση αντισωμάτων για τον HIV μπορεί να δώσει θετικό αποτέλεσμα για περισσότερες από 70 άλλες καταστάσεις (όπως η φυματίωση, η εγκυμοσύνη ή ακόμη και το εμβόλιο της γρίπης) που λέγεται ότι προκαλούν την ίδια αντισωματική απάντηση. Τα αποτελέσματα είναι ανακριβή. Την επόμενη φορά που θα προσπαθήσουν να δηλώσουν ότι τα "συγκεκριμένα" αντισώματα στοχεύουν σε συγκεκριμένους "ιούς" ή στις "πρωτεΐνες αιχμής" τους, ελπίζουμε ότι τώρα θα ξέρετε καλύτερα και θα συνειδητοποιήσετε ότι αυτό δεν ισχύει ποτέ.
---Δικτυογραφία :
Antibody Specificity? – ViroLIEgy
https://viroliegy.com/2021/11/12/antibody-specificity/