ΦΑΚΕΛΛΟΣ "ΙΟΛΟΓΙΑ": Οι Προκλήσεις Που Σχετίζονται Με Την Εξαγωγή RΝΑ Για Την Αλληλούχιση Γονιδιώματος
Μετάφραση: Απολλόδωρος
7 Φεβρουαρίου 2022 | ViroLIEgy | Διαβάστε το εδώ.
Το κρίσιμο πρώτο βήμα για τη δημιουργία ενός γονιδιώματος μετά τη διαδικασία καλλιέργειας κυττάρων είναι η εξαγωγή του RNA από το μείγμα. Ο σκοπός αυτού είναι να διασπαστεί και να απομονωθεί το RNA από τυχόν άλλα κυτταρικά συστατικά και προσμίξεις που βρίσκονται μέσα στο υπερκείμενο της καλλιέργειας. Είναι σημαντικό να κατανοήσουμε ότι μέσω αυτής της διαδικασίας, δεν διαχωρίζουν ολόκληρα «ιϊκά» σωματίδια από οτιδήποτε άλλο. Διασπούν το RNA εντός του δείγματος προκειμένου να δημιουργήσουν μια βιβλιοθήκη DNA για την αλληλούχιση του γονιδιώματος. Πολλοί μπερδεύονται όταν διαβάζουν εργασίες ιολογίας, καθώς πιστεύουν ότι όταν οι ερευνητές αναφέρουν ότι καθάρισαν RNA, αυτό σημαίνει ότι ο «ιός» καθαρίστηκε και απομονώθηκε σωστά. Μην μπερδεύεστε με τη χρήση της λέξης «καθαρισμός», καθώς μιλούν μόνο για τον καθαρισμό του RNA που επιπλέει ελεύθερα από διάφορες πηγές και όχι ολόκληρων «ιικών» σωματιδίων. Το RNA είναι ένα μείγμα πολλών πηγών, όχι μόνο του υποτιθέμενου «ιού». Ακόμα και τότε, αυτό το «καθαρισμένο» RNA μπορεί να βρίσκεται σε αποικοδομημένη μορφή ή/και να είναι γεμάτο προσμίξεις. Ας δούμε αν μπορούμε να αναλύσουμε λίγο αυτό το orocess και να το κάνουμε λίγο λιγότερο συγκεχυμένο:
Τα Bασικά: Απομόνωση RNA
«Η λήψη RNA υψηλής ποιότητας είναι το πρώτο και συχνά το πιο κρίσιμο βήμα για την εκτέλεση πολλών μοριακών τεχνικών, όπως η αντίστροφη μεταγραφή σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR), η ανάλυση του μεταγραφώματος με χρήση αλληλουχίας επόμενης γενιάς, η ανάλυση συστοιχιών, η ψηφιακή PCR, η ανάλυση βόρειου τμήματος και η κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA. Για να παραχθούν τα πιο ευαίσθητα και βιολογικά συναφή αποτελέσματα, η διαδικασία απομόνωσης RNA πρέπει να περιλαμβάνει ορισμένα σημαντικά βήματα πριν, κατά τη διάρκεια και μετά τον πραγματικό καθαρισμό του RNA».
https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/rna-isolation/general-articles/the-basics-rna-isolation.html
Η εκχύλιση του RNA γίνεται με διάφορες μεθόδους και πρέπει να γίνεται γρήγορα και προσεκτικά, καθώς το RNA δεν είναι τόσο σταθερό όσο το DNA και μπορεί να αποικοδομηθεί μάλλον εύκολα. Οι 3 κύριες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι η οργανική εκχύλιση, η εκχύλιση με στήλη spin και η εκχύλιση με μαγνητικά σωματίδια. Αυτές οι μέθοδοι περιγράφονται παρακάτω μαζί με τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά τους σε αυτό το άρθρο του 2015 από τη Roche Life Science:
Τα κορυφαία πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των διαφόρων μεθόδων εκχύλισης RNA
«Η απομόνωση RNA υψηλής ποιότητας είναι το πιο κρίσιμο βήμα για την επιτυχή εκτέλεση ενός ευρέος φάσματος δοκιμών, από την RT-qPCR ή την ανάλυση μικροσυστοιχιών έως την προετοιμασία βιβλιοθήκης cDNA, καθώς και τις μελέτες Northern blot. Είναι ακόμη και κρίσιμο για την ανάλυση μεταγραφώματος υψηλής απόδοσης με τη χρήση τεχνικών αλληλούχισης επόμενης γενιάς.
Επομένως, η βέλτιστη αξιοποίηση της διαδικασίας απομόνωσης RNA είναι απαραίτητη. Τα πειράματα υψηλής ποιότητας απαιτούν δείγματα υψηλής ποιότητας και η μεγιστοποίηση της απόδοσης της απομόνωσης μη αποικοδομημένου RNA είναι το κλειδί. Σε αυτό το άρθρο, θα συζητήσουμε τρεις από τις πιο κοινές τεχνικές εκχύλισης RNA και θα εξετάσουμε τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα για κάθε στρατηγική.
Η μέθοδος οργανικής εκχύλισης
Η οργανική εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων είναι ιστορικά η πιο κοινή, δοκιμασμένη μέθοδος για την απομόνωση RNA και την απομάκρυνση των κυτταρικών πρωτεϊνών. Αυτή η τεχνική απαιτεί ομογενοποίηση του δείγματός σας σε διάλυμα που περιέχει φαινόλη (συνήθως φαινόλη-χλωροφόρμιο). Το μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου είναι μη αναμίξιμο με το νερό, επομένως όταν φυγοκεντρείται, τα δείγματα σχηματίζουν δύο διακριτές φάσεις.
Η κατώτερη (οργανική) φάση και η διεπιφάνεια φάσης περιέχουν μετουσιωμένες πρωτεΐνες, ενώ η λιγότερο πυκνή ανώτερη (υδατική) φάση περιέχει νουκλεϊκά οξέα. Είναι σημαντικό ότι η φασική εκχύλιση του DNA και του RNA εξαρτάται από το pH, όταν το pH είναι μεγαλύτερο από 7,0, τόσο το RNA όσο και το DNA θα διαλυθούν στην υδατική φάση. Σε pH μικρότερο από 7,0, το DNA μετουσιώνεται ευκολότερα και καθιζάνει στην οργανική φάση και στη διεπιφάνεια φάσης, ενώ το RNA παραμένει στην υδατική φάση.
Η υδατική φάση που περιέχει το RNA σας αφαιρείται στη συνέχεια προσεκτικά με σιφώνιο (προσέχοντας να μην αγγίξετε τη διεπιφάνεια ή την οργανική φάση, καθώς αυτό μπορεί να επιμολύνει το δείγμα σας) και το RNA καταβυθίζεται στη συνέχεια με αλκοόλη και επανυδατώνεται για περαιτέρω ανάλυση.
Τα πλεονεκτήματα:
Η οργανική εκχύλιση είναι το χρυσό πρότυπο.
Τα πρωτόκολλα είναι καθιερωμένα και χρησιμοποιούνται συνήθως, καθιστώντας τη διαδικασία απλή για τους αρχάριους ερευνητές.
Οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται γρήγορα και το RNA σταθεροποιείται γρήγορα.
Η διαδικασία είναι εφαρμόσιμη σε μεγαλύτερα δείγματα (όπως ανθρώπινοι ή ζωικοί ιστοί) καθώς και σε μικρότερα δείγματα από πειράματα που βασίζονται σε κυτταροκαλλιέργειες.
Τα μειονεκτήματα:
Δεν είναι πολύ επιδεκτικές σε επεξεργασία υψηλής απόδοσης και είναι δύσκολο να αυτοματοποιηθούν.
Η χειροκίνητη επεξεργασία των δειγμάτων μπορεί να είναι επίπονη.
Πρέπει να γίνεται προσεκτική διαχείριση της χρήσης επικίνδυνων χημικών και χλωριωμένων οργανικών αποβλήτων.
Μέθοδος εκχύλισης με στήλη περιστροφής
Πρόκειται για μια τεχνική εκχύλισης στερεάς φάσης για τη δέσμευση και την απομόνωση RNA μέσα σε στήλες περιστροφής που βασίζονται σε φίλτρα. Αυτές οι στήλες περιστροφής χρησιμοποιούν μεμβράνες που περιέχουν διοξείδιο του πυριτίου ή ίνες γυαλιού για τη δέσμευση νουκλεϊκών οξέων. Τα δείγματα λύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει αναστολείς RNάσης και υψηλή συγκέντρωση χαοτροπικού άλατος. Τα λυτικά διαπερνούν τη μεμβράνη διοξειδίου του πυριτίου με τη χρήση φυγοκεντρικής δύναμης, με το RNA να δεσμεύεται στο πήκτωμα διοξειδίου του πυριτίου στο κατάλληλο pH.
Στη συνέχεια, η μεμβράνη που περιέχει υπολειπόμενες πρωτεΐνες και αλάτι πλένεται για την απομάκρυνση των ακαθαρσιών, ενώ η ροή απορρίπτεται. Το RNA εκλούεται στη συνέχεια με νερό ελεύθερο RNase, καθώς το RNA είναι σταθερό σε ελαφρώς όξινο περιβάλλον.
Τα πλεονεκτήματα:
Απλή, απλή διαδικασία εκτέλεσης.
Μορφή έτοιμου προς χρήση κιτ, η οποία προσθέτει ευκολία.
Δυνατότητα επεξεργασίας μεγάλης κλίμακας και υψηλής απόδοσης, συμπεριλαμβανομένων αυτοματοποιημένων μεθόδων.
Ευέλικτο για χρήση τόσο με συστήματα φυγοκέντρησης όσο και με συστήματα κενού.
Τα μειονεκτήματα:
Η εκκίνηση με υπερβολική ποσότητα δείγματος ή η ατελής ομογενοποίηση μπορεί να φράξει τη μεμβράνη ή/και να οδηγήσει σε μόλυνση με πρωτεΐνες ή γονιδιωματικό DNA.
Η ατελής κυτταρική λύση μπορεί να οδηγήσει σε χαμηλές αποδόσεις.
Τα συστήματα αυτοματισμού για φυγοκέντρηση ή κενό μπορεί να είναι ακριβά και πολύπλοκα στη ρύθμιση.
Μέθοδος εκχύλισης με μαγνητικά σωματίδια
Αυτή η στρατηγική βιοδιαχωρισμού χρησιμοποιεί σφαιρίδια με παραμαγνητικό πυρήνα (με άλλα λόγια, έχουν ιδιότητες μαγνητισμού μόνο όταν βρίσκονται κοντά σε εξωτερικό μαγνητικό πεδίο) επικαλυμμένα με, συνηθέστερα, μια μήτρα πυριτίου για τη δέσμευση νουκλεϊκών οξέων. Σε αυτή τη μέθοδο, τα κύτταρα λύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα με αναστολείς RNάσης και στη συνέχεια επωάζονται με τα μαγνητικά σφαιρίδια, επιτρέποντας στα σωματίδια να δεσμεύσουν μόρια RNA.
Τα μαγνητικά σφαιρίδια μπορούν στη συνέχεια να συλλεχθούν γρήγορα με την τοποθέτησή τους κοντά σε ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο. Το υπερκείμενο απομακρύνεται και στη συνέχεια πλένεται και επαναιωρείται με απομάκρυνση του μαγνητικού πεδίου. Η διαδικασία αυτή μπορεί εύκολα να επαναληφθεί για πολλαπλές πλύσεις. Το RNA εκλούεται από τα μαγνητικά σφαιρίδια με νερό χωρίς RNάση σε διάλυμα και το υπερκείμενο (που περιέχει το καθαρό RNA) μπορεί στη συνέχεια να μεταφερθεί.
Τα πλεονεκτήματα:
Η τεχνική απομόνωσης του RNA είναι πιο πρόσφορη για αυτοματοποίηση και μεθόδους υψηλής απόδοσης.
Τα στάδια της μαγνητικής συλλογής και της επαναιώρησης είναι γρήγορα και απλά στην εκτέλεση.
Γρήγορα και απλά στάδια μαγνητικής συλλογής και αναστολής.
Η μέθοδος χωρίς φίλτρο μειώνει την ανησυχία για απόφραξη.
Δεν υπάρχουν επικίνδυνα απόβλητα οργανικών διαλυτών.
Τα μειονεκτήματα:
Τα παχύρρευστα δείγματα μπορεί να εμποδίσουν τη μετανάστευση των μαγνητικών σφαιριδίων.
Αν και είναι πιο εύκολο να αυτοματοποιηθεί, η τεχνική αυτή μπορεί να είναι επίπονη όταν εκτελείται χειροκίνητα με μεγάλο αριθμό δειγμάτων.
Κίνδυνος μόλυνσης των δειγμάτων RNA με υπολείμματα μαγνητικών σφαιριδίων.
https://web.archive.org/web/20210226155941/https://www.lifescience.roche.com/en_us/blog/lab-life/dna-and-rna-purifation/the-top-pros-and-cons-of-different-rna-extraction-methods.html
Όπως φαίνεται, κάθε μέθοδος έχει τα δικά της πλεονεκτήματα καθώς και περιορισμούς και μειονεκτήματα. Η ελαχιστοποίηση της αποικοδόμησης του RNA είναι το κλειδί για να έχουμε ακριβή αποτελέσματα. Ωστόσο, καθεμία από αυτές τις τρεις μεθόδους μοιράζεται τον κίνδυνο μόλυνσης. Εάν το RNA είναι μολυσμένο, οι αναλύσεις που ακολουθούν, όπως οι μελέτες γονιδιακής έκφρασης και η ενίσχυση PCR, μπορούν εύκολα να διακυβευθούν. Σύμφωνα με το Methods of Enzymology, «καμία μέθοδος εκχύλισης RNA δεν μπορεί να απομακρύνει πλήρως τη μόλυνση DNA από τα παρασκευάσματα RNA». Έτσι, θα μπορούσε εύκολα να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η επιμόλυνση είναι βέβαιο ότι θα εμφανιστεί κατά τη διάρκεια της εκχύλισης RNA, η οποία απαιτεί περισσότερη επεξεργασία (όπως με DNase) σε μια προσπάθεια απομάκρυνσης τυχόν επιμολύνσεων. Αυτή η διαδικασία «καθαρισμού» του RNA από το DNA οδηγεί σε περαιτέρω υποβάθμιση του RNA, η οποία τελικά θα οδηγήσει σε λιγότερο ακριβή αποτελέσματα. Αυτά τα μειονεκτήματα διερευνώνται περαιτέρω στο ακόλουθο άρθρο:
Πώς να Καθαρίσετε RNA Υψηλής Ποιότητας
Η μέθοδος φαινόλης/χλωροφορμίου
«Αυτή είναι η παλαιότερη, δοκιμασμένη και αληθινή μέθοδος για την εκχύλιση RNA. Χρησιμοποιεί ένα απλό αλλά επίπονο πρωτόκολλο που βασίζεται στις διαφορετικές διαλυτότητες των μοριακών ειδών στους οργανικούς διαλύτες και στο νερό. Η μέθοδος φαινόλης/χλωροφορμίου μπορεί να φιλοξενήσει μεγαλύτερα δείγματα, αλλά είναι χαμηλή σε όλη τη διάρκεια και δεν αυτοματοποιείται εύκολα. Οι χρόνοι επώασης και οι θερμοκρασίες καταβύθισης είναι σημαντικές, λέει ο Matteo Beretta, μοριακός βιολόγος στην PCR Biosystems, ο οποίος χρησιμοποιεί χαμηλές θερμοκρασίες για να προστατεύσει το RNA από την αποικοδόμηση των RNAses. «Πρέπει να δοθεί προσοχή ώστε να μην διαταραχθούν οι φάσεις που σχηματίζονται κατά τη διαδικασία [για να αποφευχθεί η επιμόλυνση του RNA με DNA ή πρωτεΐνες], οπότε απαιτείται καλή ικανότητα χειρισμού», λέει ο Beretta. «Η μέθοδος φαινόλης/χλωροφορμίου δίνει συνήθως ένα ελαφρώς καθαρότερο RNA και επιτρέπει την εκχύλιση RNA από μικρότερη ποσότητα κυττάρων [σε σύγκριση με τη μέθοδο της στήλης περιστροφής που ακολουθεί]».
Η μέθοδος της στήλης περιστροφής/χρωματογραφίας στήλης
Η μέθοδος της στήλης περιστροφής χρησιμοποιεί μικρά σωληνάρια φυγοκέντρησης που περιέχουν στήλες φίλτρου με βάση το διοξείδιο του πυριτίου. Λυμένα δείγματα που έχουν υποστεί επεξεργασία με αναστολείς RNάσης και υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων περνούν μέσα από τις στήλες περιστροφής κατά τη φυγοκέντρηση, ενώ το RNA παραμένει συνδεδεμένο με το διοξείδιο του πυριτίου εντός της στήλης. Η πλύση απομακρύνει τις ακαθαρσίες, και στη συνέχεια το καθαρισμένο RNA εκλούεται από το φίλτρο πυριτίας χρησιμοποιώντας νερό.
Οι στήλες περιστροφής, που διατίθενται ευρέως σε βολική μορφή κιτ, χρησιμοποιούν συνήθως ένα απλό, γρήγορο πρωτόκολλο. Αυτό όμως μπορεί να περιπλέκεται από ατελή λύση ή ομογενοποίηση του δείγματος ή υπερφορτωμένα φίλτρα. «Είναι σημαντικό να χρησιμοποιείται κατάλληλη ποσότητα υλικού εισόδου, καθώς η χρήση υπερβολικής ποσότητας δείγματος μπορεί να μειώσει την αποτελεσματικότητα της λύσης, να εισάγει υπερβολικές ποσότητες κυτταρικών συστατικών εκτός του RNA και να θέσει σε κίνδυνο τη σύνδεση του RNA με τη στήλη καθαρισμού RNA», λέει η Danielle Freedman, ανώτερη υπεύθυνη μάρκετινγκ προϊόντων της NEB».
Η μέθοδος των μαγνητικών σφαιριδίων
«Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί μαγνητικά σφαιρίδια επικαλυμμένα με πυρίτιο ή άλλα ligands που δεσμεύουν RNA, όπως oligo(dT) για την απομόνωση μορίων mRNA με άθικτες ουρές polyA. Τα σφαιρίδια επωάζονται με κυτταρικό λύσμα και αναστολείς RNάσης, στη συνέχεια αγκυρώνονται στη θέση τους με τη χρήση μαγνητικού πεδίου, ενώ το υπερκείμενο (που περιέχει ανεπιθύμητα υπολείμματα και ακαθαρσίες) απομακρύνεται και τα σφαιρίδια πλένονται για να απομακρυνθούν οι παραμένουσες ακαθαρσίες. Με την εκ νέου αιώρηση των σφαιριδίων σε νερό εκλούεται το καθαρισμένο RNA».
Συνήθεις παγίδες και ανησυχίες
Αναστολή των RNασών
Το πρώτο μέλημα σε κάθε ροή εργασίας RNA είναι η προστασία από την αποικοδόμηση από RNάσες. «Εργαστείτε σε περιβάλλον όσο το δυνατόν πιο ελεύθερο από RNάση, οπότε πλύνετε τις επιφάνειες και τις πιπέτες, χρησιμοποιήστε νερό ελεύθερο από RNάση (επεξεργασμένο με DEPC) και αλλάξτε συχνά γάντια», λέει ο Beretta. Επίσης, προσθέστε τη δύναμη των αναστολέων RNάσης ανάλογα με τις ανάγκες. «Ο έλεγχος της RNάσης είναι το κλειδί, οπότε η χρήση αναστολέων ειδικά ή η γνώση των συνθηκών που προκαλούν αδρανοποίηση των RNασών, όπως τα ρυθμιστικά διάλυμα λύσης ή τα μέσα μεταφοράς, σε συνδυασμό με τη χρήση αναλώσιμων χωρίς RNάση, βοηθά στη διατήρηση της ακεραιότητας [του RNA]», λέει ο Andrew Gane, υπεύθυνος στρατηγικής και τεχνολογίας λύσεων γονιδιωματικής και διαγνωστικής στην Cytiva.
Λύση δειγμάτων
Ο τύπος του δείγματος θα υπαγορεύσει την κατάλληλη αυστηρότητα της λύσης, η οποία μπορεί να διαφέρει σημαντικά. Αυτό μπορεί να απαιτεί βελτιστοποίηση, καθώς η ανεπαρκής λύση σημαίνει ελλιπή απόδοση, ενώ η υπερβολικά αυστηρή λύση μπορεί να υποβαθμίσει τα μόρια RNA. «Η αποδοτικότητα της λύσης μπορεί να ρυθμιστεί λεπτομερώς συνδυάζοντας τη χημική λύση με την ενζυμική λύση και τη φυσική λύση μέσω θερμότητας ή/και μηχανικής διάσπασης», λέει ο Markus Sprenger-Haussels, αντιπρόεδρος, επικεφαλής του τμήματος τεχνολογιών δειγμάτων για την ανάπτυξη προϊόντων βιοεπιστημών της QIAGEN. «Αυτές οι παράμετροι πρέπει να είναι καλά ισορροπημένες, ώστε να αποφεύγεται ο αρνητικός αντίκτυπος στην ακεραιότητα του RNA».
Έκλουση
Οι συνθήκες έκλουσης θα πρέπει να βελτιστοποιηθούν για να βρεθεί το καλύτερο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης για τη μακροπρόθεσμη σταθερότητα του RNA, αλλά και για να αποφευχθούν παρεμβολές σε επακόλουθες μεταγενέστερες εφαρμογές. Για παράδειγμα, το αζίδιο μπορεί να επηρεάσει την ποσοτικοποίηση μέσω φασματοφωτομετρίας, το EDTA μπορεί να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα της PCR, το pH μπορεί να επηρεάσει τις ενζυμικές αντιδράσεις και «η προσθήκη RNA-φορέα μπορεί να επηρεάσει την [φασματοφωτομετρική] ποσοτικοποίηση ή τις αντιδράσεις με ολιγο(dT)», λέει ο Sprenger-Haussels.
Μόλυνση με gDNA
Η απομάκρυνση του υπολειμματικού γονιδιωματικού DNA (gDNA) από τα παρασκευάσματα RNA αποτελεί επίσης σημαντικό ζήτημα για ορισμένες downstream εφαρμογές και η βελτιστοποίηση των ροών εργασίας μπορεί να συμβάλει στη μείωση της μόλυνσης από gDNA. «Το γονιδιωματικό DNA μπορεί να παρασυρθεί από τη μεσοφάση των οργανικών εκχυλίσεων ή όταν οι μέθοδοι καθαρισμού RNA στερεάς φάσης είναι υπερφορτωμένες», λέει ο Freedman. «Για να απομακρυνθούν ίχνη γονιδιωματικού DNA από παρασκευάσματα RNA, τα δείγματα θα πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία με DNase I».
https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/572190-How-to-Purify-High-Quality-RNA/
Υπάρχουν προφανώς μερικά ζητήματα που μπορούν ενδεχομένως να ανατρέψουν τη διαδικασία εξαγωγής RNA. Η διατάραξη της υδατικής φάσης κατά την οργανική εκχύλιση μπορεί να οδηγήσει σε μόλυνση, ενώ η χρήση υπερβολικής ποσότητας υλικού δείγματος κατά την εκχύλιση με στήλη περιστροφής μπορεί να μειώσει την αποτελεσματικότητα της λύσης, να εισάγει υπερβολικές ποσότητες κυτταρικών συστατικών εκτός του RNA και να θέσει σε κίνδυνο τη σύνδεση του RNA με τη στήλη καθαρισμού RNA. Όταν χρησιμοποιούνται μαγνητικά σφαιρίδια, υπάρχει κίνδυνος μόλυνσης από υπολείμματα μαγνητικών σφαιριδίων. Άλλες παγίδες περιλαμβάνουν την αποικοδόμηση του RNA, την πολύ μικρή λύση που οδηγεί σε πολύ μικρή απόδοση, την πολύ μεγάλη λύση που οδηγεί σε αποικοδόμηση του RNA, τις ακατάλληλες συνθήκες έκλουσης που οδηγούν σε αστάθεια του RNA και τη μόλυνση από gDNA που απαιτεί επεξεργασία με DNase για την απομάκρυνση, η οποία μπορεί να προκαλέσει περαιτέρω αστάθεια του RNA. Με τόσες πολλές νάρκες στο δρόμο που μπορούν να προκαλέσουν τη διάσπαση του RNA, μοιάζει κάπως με θαύμα που υπάρχει κάτι τέτοιο όπως «ακριβή» αποτελέσματα. Οποιοδήποτε από αυτά και μόνο θα ήταν αρκετό για να υπονομεύσει τις υπόλοιπες διαδικασίες αλληλούχισης που οδηγούν σε ένα μολυσμένο γονιδίωμα.
Για να σχηματίσουμε μια καλύτερη εικόνα, παρουσιάζονται παρακάτω δύο ακόμη πηγές που εξετάζουν τους διάφορους τρόπους με τους οποίους αυτή η διαδικασία μπορεί δυνητικά να πάει στραβά. Η πρώτη προέρχεται από μια μελέτη του 2014, στην οποία φαίνεται ότι η επεξεργασία με DNase που χρησιμοποιείται για την απομάκρυνση τυχόν προσμίξεων κατά την εκχύλιση του RNA υποβάθμισε το RNA και μείωσε την απόδοση έως και 50%. Επισημαίνεται ότι μεταβλητές όπως η επιλογή των κιτ απομόνωσης RNA καθώς και η ταχύτητα και η θερμοκρασία κατά τη φυγοκέντρηση μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά την ποσότητα και την ποιότητα του RNA που λαμβάνεται. Κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η μεγαλύτερη πρόκληση στην απομόνωση RNA είναι η εξάλειψη της μόλυνσης από βακτηριακό DNA, η οποία θα επηρεάσει τις μελέτες γονιδιακής έκφρασης:
Παγίδες της απομόνωσης RNA από πτύελα ασθενούς με ΧΑΠ
Αποτελέσματα: Ο αριθμός των κυττάρων στα πτύελα κυμάνθηκε μεταξύ 0,95-7´106 κύτταρα/g πτυέλων. Η περιεκτικότητα σε απομονωμένο RNA ήταν 332,9±322,2 ng/g πτυέλων. Και οι τρεις μέθοδοι επεξεργασίας απέδωσαν παρόμοια ποσότητα RNA, με ελαφρύ πλεονέκτημα για την DTT (p=NS). Η ακεραιότητα των κυττάρων διατηρήθηκε μόνο στην DTT. Η επεξεργασία με DNάση μείωσε την απόδοση κατά 30-50%. Παραδόξως, στα περισσότερα δείγματα χρειάστηκαν αρκετοί γύροι επεξεργασίας με DNase για να καθαριστούν τα δείγματα από το μολυσματικό DNA. Η επιλογή του κιτ απομόνωσης RNA, η ταχύτητα και η θερμοκρασία φυγοκέντρησης επηρέασαν σημαντικά την ποσότητα RNA. Η επιλογή της αντίστροφης μεταγραφάσης είχε μικρότερη επίδραση στα προϊόντα PCR.
Συμπέρασμα: Η ποιότητα και η ποσότητα του RNA των πτυέλων εξαρτάται από διάφορους παράγοντες κατά την απομόνωση. Ωστόσο, η μεγαλύτερη πρόκληση είναι η εξάλειψη του βακτηριακού DNA, η οποία έχει μεγάλη σημασία, δεδομένου ότι το μολυσματικό βακτηριακό υπόβαθρο ενδέχεται να καλύψει το ανθρώπινο RNA σε μελέτες γονιδιακής έκφρασης.
https://erj.ersjournals.com/content/44/Suppl_58/P995
Επίσης, το 2014 κυκλοφόρησε ένα άρθρο που συζητά τρόπους αντιμετώπισης προβλημάτων απομόνωσης RNA. Σε αυτό επισημαίνονται σημαντικά προβλήματα όπως η μόλυνση του DNA στο RNA, η δυσκολία εντοπισμού της αποικοδόμησης του RNA, οι αναστολείς στο RNA λόγω μεταφοράς οργανικών αλάτων με αποτέλεσμα τη μόλυνση από πρωτεΐνες και η χαμηλή απόδοση RNA λόγω λαθών στη ζύγιση ή/και στην καταμέτρηση των κυττάρων.
Αντιμετώπιση προβλημάτων απομόνωσης RNA
«Όσο ευρέως και αν χρησιμοποιείται, η απομόνωση του RNA παραμένει ένα από τα πιο δύσκολα πρωτόκολλα. Σχεδόν όλοι όσοι έχουν εκτελέσει την τεχνική έχουν τις δικές τους προσωπικές συμβουλές και κόλπα για την επιτυχή απομόνωση άθικτου RNA από τα δείγματά τους με συνέπεια. Αν και το RNA μπορεί να είναι κάπως απρόβλεπτο, καθώς είναι τόσο ευμετάβλητο, υπάρχουν μερικά κοινά προβλήματα που εμφανίζονται και μπορούν να επιλυθούν.
1. Πρόβλημα: Γονιδιωματικό DNA στο RNA
Το RNA εκλούεται με γονιδιωματικό DNA, όπως αποδεικνύεται από την επάλειψη υψηλού μοριακού βάρους, ή εμφανίζεται καθαρό σε πηκτή, αλλά -RT ελέγχων ενισχύεται όταν εκτελείται PCR.
Η αιτία: Ανεξάρτητα από τη μέθοδο που χρησιμοποιείτε για την απομόνωση του RNA, ίχνη DNA μεταφέρονται πάντα. Αυτό ισχύει με τις προετοιμασίες TRIzol (φαινόλη) και με τα φίλτρα περιστροφής πυριτίου. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή διάτμηση του γονιδιωματικού DNA κατά την ομογενοποίηση. Εάν χρησιμοποιείτε τη μέθοδο της φαινόλης, το pH της φαινόλης είναι το κλειδί (πρέπει να είναι όξινο) και η ικανότητά σας να πιπετάρετε μόνο την υδατική φάση θα έχει ως αποτέλεσμα περισσότερη ή λιγότερη μόλυνση DNA».
2. Πρόβλημα: Υποβαθμισμένο RNA/ χαμηλή ακεραιότητα
«Οι ζώνες rRNA εμφανίζονται λερωμένες σε πηκτή ή η ζώνη 18s είναι πιο έντονη από τη ζώνη 28s. Στον βιοαναλυτή Agilent Bioanalyzer, βλέπετε μια μεγαλύτερη κορυφή 18s.
Αιτία: Η υποβάθμιση συνέβη σε κάποιο σημείο κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας. Αυτό μπορεί να είναι δύσκολο να εντοπιστεί. Θα μπορούσε να έχει συμβεί κατά τη συλλογή και την αποθήκευση ή ενδεχομένως κατά την εκχύλιση. Θα μπορούσε επίσης να έχει συμβεί μετά την απομόνωση».
3. Πρόβλημα: Αναστολείς στο RNA
«Το RNA έχει ασυνήθιστα χαμηλή ένδειξη 260/230 (κάτω από 1,0) ή 260/280 ή δεν λειτουργεί στην αντίστροφη μεταγραφή.
Αιτία: Μια χαμηλή τιμή 260/230 σε μια προετοιμασία RNA είναι ενδεικτική της μεταφοράς αλάτων γουανιδίνης στο δείγμα ή οργανικών αναστολέων (όπως χουμικά οξέα ή πολυσακχαρίτες, εάν το δείγμα είναι περιβαλλοντικό). Τα άλατα γουανιδίνης χρησιμοποιούνται στο TRIzol και στα preps πυριτίου. Αυτά τα άλατα αδρανοποιούν τις RNάσες, αλλά αναστέλλουν επίσης πρωτεΐνες όπως τα ένζυμα RT, εάν υπάρχουν στο τελικό RNA. Μια χαμηλή μέτρηση 260/280 υποδεικνύει μόλυνση από πρωτεΐνες.
4. Πρόβλημα: Χαμηλές αποδόσεις RNA
«Η απόδοση του RNA είναι χαμηλότερη από την αναμενόμενη - είτε με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματά σας, είτε, με βάση τις αναφερόμενες αποδόσεις για έναν συγκεκριμένο ιστό ή τύπο κυττάρου. Οι αποδόσεις RNA μπορεί να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ διαφορετικών τύπων καλλιεργούμενων κυττάρων και σε διαφορετικούς ιστούς. Για το RNA του αίματος, μπορεί να διαφέρει από άτομο σε άτομο.
Αιτία: Εάν η απόδοση του RNA είναι χαμηλότερη από ό,τι περιμένατε ή γνωρίζετε ότι θα έπρεπε να είναι, και το RNA είναι άθικτο (διάβαζε: δεν έχει αποικοδομηθεί) , τότε η ομογενοποίηση μπορεί να μην ήταν πλήρης. Για την απομόνωση του RNA, μια ισχυρή λύση είναι το κλειδί. Οι ιστοί που είναι αποθηκευμένοι σε RNALater τείνουν να είναι λίγο πιο δύσκολο να ομογενοποιηθούν. Οι χαμηλές αποδόσεις θα μπορούσαν να προκληθούν από λάθη στη ζύγιση των ιστών ή στις μετρήσεις των κυττάρων για τα καλλιεργημένα κύτταρα. Μπορεί να έχετε λιγότερα κύτταρα από όσα νομίζετε. Με το RNA του αίματος, το buffy coat μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με την ικανότητά σας στη συλλογή της στιβάδας των λευκών αιμοσφαιρίων και τον κάθε ασθενή ξεχωριστά».
Συνοψίζοντας:
Η λήψη υψηλής ποιότητας RNA είναι το πρώτο και συχνά το πιο κρίσιμο βήμα για την εκτέλεση πολλών μοριακών τεχνικών, όπως η αντίστροφη μεταγραφή σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR), η ανάλυση του μεταγραφώματος με χρήση αλληλουχίας επόμενης γενιάς, η ανάλυση συστοιχιών, η ψηφιακή PCR, η ανάλυση βόρειου τμήματος και η κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA.
Τα πειράματα υψηλής ποιότητας απαιτούν δείγματα υψηλής ποιότητας και η μεγιστοποίηση της απόδοσης της απομόνωσης μη αποικοδομημένου RNA είναι το κλειδί
Οι 3 κύριες μέθοδοι εκχύλισης RNA είναι οι εξής:
Οργανική εκχύλιση
Εκχύλιση με στήλη spin
Εκχύλιση με μαγνητικά σωματίδια
Κάθε μέθοδος έχει τα δικά της μειονεκτήματα και περιορισμούς
Με τη μέθοδο της οργανικής εκχύλισης, η υδατική φάση που περιέχει RNA πρέπει να αφαιρεθεί προσεκτικά με πιπέτα, προσέχοντας να μην αγγίξετε τη διεπιφάνεια ή την οργανική φάση, καθώς αυτό μπορεί να μολύνει το δείγμα σας
Με τη μέθοδο εκχύλισης με στήλη περιστροφής, η εκκίνηση με υπερβολική ποσότητα δείγματος ή η ατελής ομογενοποίηση μπορεί να φράξει τη μεμβράνη ή/και να οδηγήσει σε μόλυνση με πρωτεΐνες ή γονιδιωματικό DNA
Με τη μέθοδο εκχύλισης με μαγνητικά σωματίδια, υπάρχει κίνδυνος μόλυνσης των δειγμάτων RNA με υπολείμματα μαγνητικών σφαιριδίων
Άλλα ζητήματα περιλαμβάνουν:
Αναστολή της RNάσης που οδηγεί στην αποικοδόμηση του RNA
Ανεπαρκής λύση που οδηγεί σε ελλιπή απόδοση ή υπερβολικά αυστηρή λύση που υποβαθμίζει τα μόρια RNA
Ακατάλληλες συνθήκες έκλουσης που οδηγούν σε μακροχρόνια αστάθεια RNA και παρεμβολή σε μεταγενέστερες εφαρμογές.
Μεταφορά μολυσματικού γονιδιωματικού DNA από τη μεσοφάση οργανικών εκχυλίσεων ή όταν οι μέθοδοι καθαρισμού RNA στερεάς φάσης είναι υπερφορτωμένες.
Όσον αφορά την εκχύλιση RNA από πτύελα, μια μελέτη διαπίστωσε ότι η εξάλειψη της μόλυνσης από βακτηριακό DNA ήταν η μεγαλύτερη πρόκληση που μπορεί τελικά να καλύψει το ανθρώπινο RNA
Η επεξεργασία με DNάση μείωσε την απόδοση κατά 30-50% και στα περισσότερα δείγματα χρειάστηκαν αρκετοί γύροι επεξεργασίας με DNάση για να καθαριστούν τα δείγματα από το μολυσματικό DNA
Η επιλογή του κιτ απομόνωσης RNA, η ταχύτητα και η θερμοκρασία φυγοκέντρησης επηρέασαν σημαντικά την ποσότητα του RNA
Ανεξάρτητα από τη μέθοδο που χρησιμοποιείται για την απομόνωση του RNA, ίχνη DNA μεταφέρονται πάντα
Η επιδεξιότητα στη διοχέτευση με πιπέτα μόνο της υδατικής φάσης θα έχει ως αποτέλεσμα περισσότερη ή λιγότερη μόλυνση από DNA
Το υποβαθμισμένο RNA/χαμηλή ακεραιότητα είναι δύσκολο να εντοπιστεί και μπορεί να συμβεί κατά τη συλλογή και την αποθήκευση, κατά την εκχύλιση ή μπορεί να συμβεί μετά την απομόνωση
Ένα χαμηλό 260/230 σε μια προετοιμασία RNA είναι ενδεικτικό της μεταφοράς αλάτων γουανιδίνης στο δείγμα ή οργανικών αναστολέων και υποδεικνύει μόλυνση από πρωτεΐνες.
Οι αποδόσεις RNA μπορεί να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ διαφορετικών τύπων καλλιεργούμενων κυττάρων και διαφορετικών ιστών.
Οι χαμηλές αποδόσεις μπορεί να οφείλονται σε λάθη στη ζύγιση των ιστών ή στον υπολογισμό των κυττάρων για τα καλλιεργημένα κύτταρα.
Ο καθαρισμός RNA δεν είναι το ίδιο με τα αρχικά βήματα που υποτίθεται ότι χρησιμοποιούνται κατά τον καθαρισμό και την απομόνωση «ιών» προκειμένου να αποδειχθεί η ύπαρξη και η παθογένειά τους. Όπως ορίζεται από το Science Direct, η απομόνωση ολικού RNA είναι η μέθοδος που βοηθά στον διαχωρισμό του καθαρού RNA από τους ιστούς και τα μείγματα DNA ή πρωτεϊνών. Ουσιαστικά διασπούν χημικά τα πάντα στο δείγμα σε RNA, έτσι ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διάφορες γονιδιωματικές εφαρμογές. Κατά τη διαδικασία αυτή δεν λαμβάνονται ολόκληρα σωματίδια «ιού». Το «καθαρό» RNA που προκύπτει είναι ένα μείγμα από πολλές πηγές. Ωστόσο, είναι σαφές ότι οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή RNA είτε από κυτταροκαλλιέργειες είτε απευθείας από κλινικά δείγματα είναι γεμάτες με πιθανά προβλήματα όσον αφορά τη μόλυνση και την αποικοδόμηση του RNA. Τυχόν σφάλματα σε αυτό το πρώτο κρίσιμο βήμα θα επηρεάσουν τα επόμενα βήματα της διαδικασίας αλληλούχισης και θα οδηγήσουν σε προβλήματα αξιοπιστίας και ακρίβειας της αλληλούχισης ενός γονιδιώματος. Αυτό σημαίνει ότι τα κομμάτια του παζλ που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία της εικόνας θα είναι ανακριβή. Εάν τα κομμάτια του παζλ είναι ανακριβή, τι λέει αυτό για το παζλ;
Παρακαλώ βοηθήστε να στηρίξετε το έργο μου. 🙏
----Δικτυογραφία :
The Challenges Related to RNA Extraction for Genome Sequencing – ViroLIEgy
https://viroliegy.com/2022/02/07/the-challenges-related-to-rna-extraction-for-genome-sequencing/