Ιϊκό Φορτίο και PCR - Γιατί Δεν Μπορούν να Χρησιμοποιηθούν για την Απόδειξη της Μόλυνσης από τον HIV.
Μετάφραση: Απολλόδωρος
Continuuum Vol.6/No.3/Summer/Autumn 2001 | Christine Johnson | Διαβάστε το εδώ
"Η εκδοχή της βιοτεχνολογίας της (φωτοτυπικής) μηχανής Xerox" - έτσι αποκάλεσε το περιοδικό Forbes την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Αυτή η επαναστατική τεχνική επιτρέπει σε έναν επιστήμονα να πάρει ένα δείγμα που περιέχει μια ελάχιστη ποσότητα DNA και να αναπαράγει αυτή την αλληλουχία DNA μέχρι να υπάρχουν ένα εκατομμύριο αντίγραφα αντί για ένα ή δύο.
Ο Kary Mullis, εφευρέτης της PCR, κέρδισε το 1993 το βραβείο Νόμπελ για την εφεύρεσή του, η οποία έχει γίνει απαραίτητη σε κάθε εργαστήριο γενετικής. Είναι ειρωνικό το γεγονός ότι μια από τις πρώτες εφαρμογές της PCR ήταν η ανίχνευση του ιού HIV, δεδομένου ότι ο ίδιος ο Mullis δεν πιστεύει ότι η εφεύρεσή του είναι ικανή για κάτι τέτοιο. Ο Mullis δηλώνει ότι το πρόβλημα είναι ότι η PCR είναι υπερβολικά αποτελεσματική - θα ενισχύσει όποιο DNA υπάρχει στο δείγμα, ανεξάρτητα από το αν αυτό το DNA ανήκει στον HIV ή σε κάποια επιμόλυνση. Και πώς αποφασίζετε ποιο μέρος του ενισχυμένου υλικού θα μπορούσε να είναι ο HIV και ποιο/α μέρος/η η επιμόλυνση, αν δεν θα μπορούσατε να ανιχνεύσετε τον HIV στο δείγμα χωρίς τη χρήση PCR;
Ένα από τα κύρια επιχειρήματα κατά της υπόθεσης HIV/AIDS είναι ότι, όταν χρησιμοποιούνται οι παραδοσιακές μέθοδοι ανίχνευσης του ιού, ο HIV δεν έχει ποτέ συναχθεί σε σημαντικές ποσότητες σε άτομα με AIDS. Η καλλιέργεια ιών, για παράδειγμα, ήταν επαρκής για την ανεύρεση άλλων ιών, αλλά όχι του HIV. Γιατί όχι; Όταν χρησιμοποιούνται καλλιέργειες ιών για την ανίχνευση του HIV, ο HIV δεν εμφανίζεται ποτέ ούτε καν αναζητείται στις καλλιέργειες. Η παρουσία του μετράται με πολύ έμμεσες μεθόδους: δοκιμασίες ανίχνευσης της αντίστροφης μεταγραφάσης ή μιας πρωτεΐνης p24, καμία από τις οποίες δεν είναι ειδική για τον HIV. Οι έμμεσες μέθοδοι δεν θα ήταν απαραίτητες εάν υπήρχε εξαρχής σημαντική ποσότητα HIV.
Με άλλα λόγια, εάν υπήρχε μια σημαντική ποσότητα HIV, οι πατροπαράδοτες εργαστηριακές τεχνικές θα έπρεπε να είναι σε θέση να τον εντοπίσουν. Δεν μπορούν. Τώρα χρειαζόμαστε όχι μόνο την PCR, αλλά και συνεχείς τροποποιήσεις και βελτιώσεις της PCR, προκειμένου να προσπαθήσουμε να βρούμε τον HIV.
Έτσι προέκυψε η ιδέα του "ιϊκού φορτίου", εμπνευσμένη από δύο κύματα επιστημονικών εργασιών που υποστήριζαν ότι ο HIV πολλαπλασιάζεται με σπουδή κατά δισεκατομμύρια: αρχικά, εργασίες που υποστήριζαν ότι ο HIV "κρύβεται στους λεμφαδένες" [1,2] και πιο πρόσφατα, οι εργασίες των Ho και Wei. [3,4]
Οι τελευταίες μελέτες προσπάθησαν να μετρήσουν το "ιϊκό φορτίο" σε ένα δεδομένο σημείο, μετά το οποίο χορηγήθηκαν στον ασθενή "αντιϊκά" φάρμακα. Τα φάρμακα υποτίθεται ότι θα εμπόδιζαν τον πολλαπλασιασμό οποιουδήποτε νέου HIV και το ιϊκό φορτίο θα μειωνόταν αναλόγως. Ωστόσο, μέσα σε λίγες ημέρες, ο εναπομείναντας ιός θα μεταλλάσσονταν σε μια μορφή ανθεκτική στα φάρμακα, και σε λίγες εβδομάδες το ιικό φορτίο θα επέστρεφε στα προ της θεραπείας επίπεδα. Εφαρμόζοντας έναν μαθηματικό τύπο σε αυτή τη δυναμική, ο ρυθμός με τον οποίο ο ιός αναπαράγεται φέρεται να προσδιορίστηκε.
Έτσι γεννήθηκε αυτό που ονομάζω "θεωρία του νεροχύτη της κουζίνας του Dr. Ho". Σύμφωνα με τον Ho, κάθε μέρα δημιουργούνται δισεκατομμύρια αντίγραφα του HIV, τα οποία μολύνουν δισεκατομμύρια Τ4-κύτταρα. Αυτά τα Τ-κύτταρα δεν καταστρέφονται από τον HIV, αλλά από το ανοσοποιητικό σύστημα. Αναπληρώνονται καθημερινά, αλλά με την πάροδο των ετών το ανοσοποιητικό σύστημα χάνει έδαφος και ο HIV τελικά κερδίζει. Αυτή η διαδικασία παρομοιάστηκε με έναν νεροχύτη με ανοιχτή την αποχέτευση, όπου το νερό εισρέει από μια βρύση (νέα Τ-κύτταρα που δημιουργούνται) με ελαφρώς μικρότερο ρυθμό από ό,τι αποχετεύεται (μολυσμένα Τ-κύτταρα που καταστρέφονται).
Είναι πολύ σημαντικό να σημειωθεί ότι όλες οι μελέτες ιϊκού φορτίου βασίζονται πλήρως στην PCR και τις συναφείς τεχνικές. Αυτό το άρθρο θα απαξιώσει την PCR ως ακριβή μέθοδο προσδιορισμού της μόλυνσης από τον HIV, γεγονός που με τη σειρά του θα θέσει υπό αμφισβήτηση οποιαδήποτε συμπεράσματα σχετικά με τον HIV που έχουν γίνει με βάση τις τεχνικές PCR.
ΜΕΡΙΚΑ ΒΑΣΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΓΙΑ ΤΟ DNA
Η PCR εκμεταλλεύεται ορισμένες θεμελιώδεις ιδιότητες του DNA. Το DNA (όπως και το RNA) είναι ένα νουκλεϊκό οξύ και τα νουκλεϊκά οξέα αποτελούνται από νουκλεοτιδικές "δομικές μονάδες". Το DNA υπάρχει ως δύο συμπληρωματικοί κλώνοι διατεταγμένοι σε σχηματισμό διπλής έλικας (δύο αλληλοδιαπλεκόμενες σπείρες). Οι κλώνοι αυτοί αποτελούνται από πολλά νουκλεοτίδια αγκιστρωμένα μεταξύ τους για να σχηματίσουν μια μακριά αλυσίδα DNA.
Το μόριο των νουκλεοτιδίων αποτελείται από τρία διαφορετικά μέρη: το φωσφορικό και το σάκχαρο (τα οποία σχηματίζουν μια ραχοκοκαλιά ή μια δομή που μοιάζει με κορδέλα) και τη βάση. Υπάρχουν τέσσερις τύποι βάσεων: A, T, C και G (αδενίνη, θυμίνη, κυτοσίνη και γουανίνη). Αυτές οι βάσεις συνδέονται με τη ραχοκοκαλιά, η οποία είναι τυλιγμένη στη γνωστή διπλή έλικα.
Οι βάσεις του ενός σκέλους συνδέονται με τις βάσεις του άλλου σκέλους και αυτό δίνει στο DNA τη σταθερή δομή της διπλής έλικας. (Σκεφτείτε ότι οι δύο αλυσίδες σχηματίζουν ένα ανεβασμένο φερμουάρ.) Η ξεχωριστή φύση του κώδικα DNA ενός οργανισμού εξαρτάται από τη σειρά ή την αλληλουχία των βάσεων κατά μήκος της αλυσίδας του DNA.
Υπάρχουν ειδικοί κανόνες σχετικά με το πώς οι βάσεις σχηματίζουν χημικούς δεσμούς με άλλες βάσεις: ένα Α θα συνδεθεί μόνο με ένα Τ, και ένα C θα συνδεθεί μόνο με ένα G. Μια βάση στο ένα σκέλος που συνδέεται με μια βάση στο άλλο σκέλος ονομάζεται "συμπληρωματικό ζεύγος βάσεων". Αυτός ο κανόνας της συμπληρωματικής σύζευξης βάσεων είναι που δίνει στο DNA την ικανότητά του να αναπαράγεται με ακρίβεια.
Κάθε φορά που ένα κύτταρο διαιρείται, πρέπει να δημιουργεί ένα αντίγραφο του DNA του για το νέο κύτταρο. Η διπλή αλυσίδα του DNA πρώτα "ξεκουμπώνει" τον εαυτό της σε δύο ξεχωριστές αλυσίδες. Κάθε μονή κλωστή χρησιμεύει ως πρότυπο, ή μοτίβο, από το οποίο δημιουργείται ένα νέο αντίγραφο της συμπληρωματικής του κλωστής. (Έτσι, η αλυσίδα #1 χρησιμεύει ως πρότυπο για την κατασκευή ενός νέου αντιγράφου της αλυσίδας #2, και αντίστροφα). Το μονόκλωνο στη συνέχεια ενσωματώνει νέα δομικά στοιχεία νουκλεοτιδίων από το περιβάλλον μέσο σύμφωνα με τον κανόνα της συμπληρωματικής σύζευξης βάσεων. Με άλλα λόγια, ένα διαθέσιμο Α στο μονόκλωνο θα προσκολληθεί σε ένα νουκλεοτίδιο Τ, ένα C θα προσκολληθεί σε ένα G κ.ο.κ. μέχρι να αντιγραφεί ολόκληρο το αντίθετο σκέλος. Στο τέλος αυτής της διαδικασίας, οι δύο αρχικές αλυσίδες φερμουάρουν ξανά και οι δύο αντιγραμμένες αλυσίδες χρησιμεύουν ως DNA για ένα νέο κύτταρο.
Πως Λειτουργεί η PCR
Η θεωρία για τον HIV λέει ότι, όπως και άλλοι προτεινόμενοι ρετροϊοί, περιέχει RNA αλλά όχι DNA: όταν ο HIV λέγεται ότι μολύνει ένα κύτταρο, το ένζυμο της αντίστροφης μεταγραφάσης θεωρείται ότι μετατρέπει το RNA σε συμπληρωματικό DNA, το οποίο στη συνέχεια εισάγεται στο DNA του κυττάρου ξενιστή.
Επομένως, αν η PCR χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση ανθρώπινου ιστού για την παρουσία του HIV, θα αναζητηθεί μόνο ένα μικρό τμήμα από ολόκληρη την αλυσίδα του κυτταρικού DNA. Αυτό το σύντομο τμήμα αντιπροσωπεύει το γενετικό υλικό που προτείνεται για τον HIV, το οποίο θεωρητικά έχει ενσωματωθεί στο DNA του κυττάρου. (Οι μελέτες ιικού φορτίου προσπαθούν να αναζητήσουν τον HIV χωρίς κύτταρα. Ακόμα και εδώ, η PCR αναζητά μόνο ένα τμήμα ολόκληρου του προτεινόμενου γενετικού πακέτου του HIV, ή γονιδιώματος, και όχι έναν ολόκληρο ιό).
Η PCR Λειτουργεί με τον Ακόλουθο Τρόπο
Βήμα 1: Θέρμανση του στόχου/εκμαγείου
Ένα μακρύ κομμάτι DNA που περιέχει το μικρότερο τμήμα που πρόκειται να αντιγραφεί θερμαίνεται. Οι δύο αλυσίδες μπορούν να "λιώσουν" διαχωριζόμενες μεταξύ τους σε υψηλές θερμοκρασίες και θα επανέλθουν/συγκολληθούν σιγά-σιγά μαζί κατά την ψύξη ("ανόπτηση"). Οι δύο διαχωρισμένες αλυσίδες είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους. Χρησιμεύουν ως στόχοι/εκμαγεία για τις νέες αλυσίδες.
Βήμα 2: Προσθήκη των Εκκινητών (primers)
Κάτι που ονομάζεται εκκινητής (primer) είναι απαραίτητο για το επόμενο βήμα. Οι εκκινητές είναι νουκλεοτίδια που σχηματίζουν μια σύντομη αλληλουχία νέας αλυσίδας. Οι εκκινητές σχεδιάζονται έτσι ώστε να είναι συμπληρωματικοί σε μια γνωστή αλληλουχία που αποτελεί μέρος μιας μεγαλύτερης αλληλουχίας, και έτσι είναι γνωστό το σημείο στο οποίο θα συνδεθούν (ή θα υβριδοποιηθούν) οι εκκινητές.
Οι εκκινητές προσδένονται σε κάθε άκρο του τμήματος DNA που πρόκειται να αντιγραφεί (το τμήμα που αντιπροσωπεύει το προτεινόμενο γενετικό υλικό του HIV). Οι εκκινητές εξυπηρετούν δύο σκοπούς: α) να επισημάνουν κάθε άκρο του στοχευόμενου τμήματος, ώστε να ενισχυθεί μόνο αυτό το τμήμα και όχι ολόκληρη η αλυσίδα, και β) να ξεκινήσει η διαδικασία αντιγραφής. Οι νέες αλυσίδες χτίζονται τετράγωνο προς τετράγωνο με τη δράση ενός ενζύμου που ονομάζεται πολυμεράση. Η πολυμεράση χτίζει μια νέα αλυσίδα DNA παράλληλα με μια υπάρχουσα αλυσίδα. Η πολυμεράση δεν θα λειτουργήσει αν η παλιά αλυσίδα (ο στόχος/εκμαγείο) δεν έχει ήδη πάνω της μερικά νουκλεοτίδια που σχηματίζουν μια σύντομη αλληλουχία της νέας αλυσίδας (τον εκκινητή). (Αν δείτε ποτέ μια αναφορά σε "template-primer", γι' αυτό ακριβώς μιλάνε).
Με άλλα λόγια, η πολυμεράση μπορεί να σχηματίσει μια νέα αλυσίδα μόνο εάν η νέα αλυσίδα έχει ήδη σχηματιστεί εν μέρει. Στη φύση, όταν το δικό σας DNA διπλασιάζεται, άλλα ένζυμα που ονομάζονται DNA πριμάσες (primases) σχηματίζουν τον εκκινητή πάνω στην παλιά αλυσίδα.
Μόλις η πολυμεράση πάρει μπρος, σέρνεται κατά μήκος της μονής αλυσίδας του DNA (το πρότυπο) προσθέτοντας σε αυτήν ένα προς ένα τα δομικά στοιχεία των νουκλεοτιδίων. Ο εκκινητής καταλήγει να αποτελεί μέρος του νέου κλώνου.
Στη φύση, οι πολυμεράσες τραβούν τις αλυσίδες του DNA χώρια ενώ χτίζουν τη νέα αλυσίδα του DNA. Με αυτόν τον τρόπο δημιουργούνται διπλά αντίγραφα του DNA, ώστε κύτταρα όπως τα κύτταρα του αίματος και του δέρματος να μπορούν να διαιρούνται σε δύο νέα κύτταρα, μια διαδικασία απαραίτητη για τη ζωή.
Βήμα 3: Ενίσχυση
Για άλλη μια φορά, αφού λιώσει και στη συνέχεια προσκολληθο'ν (annealing) οι εκκινητές, το ένζυμο πολυμεράση αντιγράφει το DNA ξεκινώντας από τον εκκινητή, δημιουργώντας ένα νέο αντίγραφο κάθε τμήματος-στόχου. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για 30-40 γύρους. Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου, η ποσότητα των τμημάτων διπλασιάζεται, οπότε τα δύο τμήματα γίνονται τέσσερα, τα τέσσερα γίνονται οκτώ, στη συνέχεια 16 κ.λπ. Στο τέλος της διαδικασίας, έχουν δημιουργηθεί περίπου ένα εκατομμύριο αντίγραφα του αρχικού τμήματος. Τώρα έχετε ένα σωρό DNA, ενώ αρχικά είχατε μόνο μια απειροελάχιστη ποσότητα. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η PCR αναφέρεται ως ικανότητα εύρεσης "βελόνας στα άχυρα".
Προφανώς, είναι απαραίτητο οι εκκινητές να είναι ειδικοί για τον HIV. Το αν η PCR θα παράγει ένα ενισχυμένο προϊόν ("θετική PCR") εξαρτάται από το αν οι εκκινητές που προσθέτετε ταιριάζουν με μέρος του DNA στο δείγμα-στόχο.
Παρακάτω, θα δούμε ότι η ειδικότητα των εκκινητών για τον HIV είναι αμφίβολη. Ακόμη και αν οι εκκινητές ήταν ειδικοί για τον HIV, αν υπάρχουν παρόμοιες αλληλουχίες στο δείγμα-στόχο, οι εκκινητές, υπό χαλαρές συνθήκες, θα σχηματίσουν υβρίδια με (ή θα δεσμεύσουν) συγγενείς αλληλουχίες που δεν είναι απόλυτα συμβατές.
Στη συνέχεια, θα προετοιμάσουν την πολυμεράση, η οποία ξεκινά τη διαδικασία ενίσχυσης, ακόμη και αν δεν υπήρχε αρχικά ο HIV.
ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ PCR ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΕΥΡΕΣΗ TOY HIV
Ένα πρόβλημα για την υπόθεση του HIV ήταν ότι, ακόμη και με τη χρήση της τυπικής PCR, οι ερευνητές δεν μπορούσαν να βρουν πολύ, ή και καθόλου, HIV σε άτομα με διάγνωση AIDS. Για να επιλύσουν αυτό το παράδοξο, οι συγγραφείς των νέων εγγράφων για το "ιϊκό φορτίο" επινόησαν δύο τροποποιήσεις της PCR, οι οποίες, όπως ισχυρίστηκαν, ήταν πολύ πιο αποτελεσματικές στην ανεύρεση του HIV. Αυτές ήταν η QC-PCR και η εξέταση διακλαδισμένου DNA (bDNA). Και ξαφνικά -εύρηκα- βρέθηκαν δισεκατομμύρια αντίγραφα αυτού που θεωρούσαν ότι ήταν ο HIV. Η αντίφαση εδώ φαίνεται ότι διέφυγε από τους συγγραφείς αυτών των εγγράφων: Γιατί να χρειάζονται καθόλου τέτοιες ισχυρές νέες εξετάσεις για να βρεθεί ένα μικρόβιο που υπάρχει σε δισεκατομμύρια; Οι παραδοσιακές μέθοδοι θα έπρεπε να αρκούν.
QC-PCR
Αυτή είναι η εξέταση που χρησιμοποιήθηκε στις προαναφερθείσες εργασίες των Anthony Fauci (Pantaleo) και Ashley Haase (Embretson), οι οποίες υποστήριζαν ότι ο HIV "κρύβεται στους λεμφαδένες". Οι εργασίες αυτές έγιναν δεκτές ως γεγονός, παρόλο που η QC-PCR ήταν και παραμένει μια μη επικυρωμένη τεχνική.
Ο Mark Craddock, του Πανεπιστημίου του Σίδνεϊ (Αυστραλία), εξήγησε τις αρχές και τα προβλήματα της QC-PCR ως εξής: [8]
"Η PCR παράγει μαζικά θραύσματα DNA. Ξεκινάτε με μια μικρή ποσότητα DNA και μετά από κάθε κύκλο PCR, η ποσότητα του DNA που έχετε είναι μεταξύ μία και δύο φορές μεγαλύτερη από την ποσότητα στην αρχή του κύκλου. Έτσι, η ποσότητα του DNA που έχετε να μελετήσετε αυξάνεται εκθετικά. Το γεγονός ότι η PCR είναι μια διαδικασία εκθετικής ανάπτυξης σημαίνει ότι τα πειραματικά σφάλματα θα αυξηθούν επίσης εκθετικά, οπότε πρέπει να είστε πολύ προσεκτικοί σε ό,τι κάνετε με τη διαδικασία.
"Ορισμένοι άνθρωποι αποφάσισαν ότι θα πρέπει να είναι δυνατή η εκτίμηση της ποσότητας του DNA που υπάρχει σε ένα δείγμα με τη χρήση της PCR. Πρόκειται για τη λεγόμενη ποσοτική ανταγωνιστική PCR. Η ιδέα είναι να προστεθεί στο προς εκτίμηση δείγμα μια γνωστή ποσότητα παρόμοιου αλλά διακριτού DNA και να ενισχυθούν και τα δύο μαζί. Η υπόθεση είναι ότι οι σχετικές ποσότητες των δύο προϊόντων θα πρέπει να παραμένουν ίδιες, και ως εκ τούτου μπορείτε να υπολογίσετε το μέγεθος του δείγματος με το οποίο ξεκινήσατε γνωρίζοντας την αναλογία των δύο, η οποία προσδιορίζεται από την παρατήρηση όταν η PCR έχει παράγει αρκετή ποσότητα και των δύο για να μετρηθεί, καθώς και πόση ποσότητα DNA ελέγχου προστέθηκε.
"Αυτό που είναι απολύτως κρίσιμο είναι ότι οι σχετικές ποσότητες του δοκιμαστικού DNA και του γνωστού σας ελέγχου πρέπει να παραμείνουν ακριβώς ίσες. Το κοντινό δεν είναι αρκετά καλό. Οι παραμικρές διαφορές θα μεγεθυνθούν εκθετικά και μπορεί να προκαλέσουν τεράστια σφάλματα στην εκτίμησή σας.
"Οι δυσκολίες στην ποσοτική χρήση της PCR επισημάνθηκαν από τον Luc Raeymaekers στο περιοδικό Analytical Biochemistry το 1993. Σημείωσε ότι οι δημοσιευμένες εργασίες σχετικά με την QC-PCR περιέχουν δεδομένα που δείχνουν ότι η θεμελιώδης υπόθεση ότι τα σχετικά μεγέθη των δειγμάτων παραμένουν σταθερά δεν ικανοποιείται στην πράξη. Παρόλα αυτά, οι ερευνητές του HIV συνεχίζουν να χρησιμοποιούν την PCR για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ιικού φορτίου. Απλώς δεν υπάρχει τρόπος να γνωρίζουμε αν μια δεδομένη εκτίμηση είναι σωστή ή αν είναι 100.000 φορές υπερβολικά υψηλή!"
Ο Todd Miller αποκαλεί την QC-PCR "την τελευταία μόδα της επιστήμης" και συμφωνεί ότι εάν οι σχετικές ποσότητες του DNA της εξέτασης και του γνωστού ελέγχου δεν είναι ίσες, υπάρχει ένα πράγμα που μπορείτε να πείτε με βεβαιότητα για την εκτίμηση του αρχικού σας στόχου (την ποσότητα του προτεινόμενου HIV RNA στο δείγμα αίματος του ασθενούς): Θα είναι λάθος.
Πώς η QC-PCR, με όλα τα ελαττώματά της, έγινε αποδεκτή εξέταση για τον HIV; Ο Miller εξηγεί:
"Ο τρόπος με τον οποίο εκδηλώθηκε αυτή η κατάσταση στη σύγχρονη επιστήμη είναι ο εξής: Πρώτα κάποιοι άνθρωποι ξοδεύουν πολύ χρόνο προσπαθώντας να κάνουν αυτό το τεστ να δουλέψει, και αν είναι τυχεροί, καταλήγουν να δημοσιεύουν άρθρα σχετικά με τις επιφυλάξεις της διαδικασίας. Δεύτερον, άλλοι τυχαίνει να καταφέρουν να τους δώσει το τεστ μια απάντηση που "βγάζει νόημα" και δημοσιεύουν τα δεδομένα τους ως σημαντική συνεισφορά στον τομέα. Τρίτον, λόγω του σχετικού νεωτερισμού και της μυστικοπαθούς φύσης της, παραμένει ως οιονεί αποδεκτή με πολλούς παθητικούς σκεπτικιστές και λίγους χρήστες. Ωστόσο, οι περισσότεροι που το χρησιμοποιούν ενδιαφέρονται περισσότερο για το δικό τους αγαπημένο φαινόμενο παρά για τη μηχανική της αντίδρασης".
bDNA - PCR Διακλαδισμένου DNA
Αυτό είναι το τεστ που χρησιμοποιήθηκε στην εργασία του Ho. Αν και δεν είναι, αυστηρά μιλώντας, PCR, αναφέρεται ως τέτοια, δεδομένου ότι ενσωματώνει τεχνολογία τύπου PCR. Η διαφορά είναι ότι το bDNA ενισχύει το σήμα και όχι τον στόχο. Δηλαδή, η συνήθης PCR κάνει περισσότερο τον στόχο ώστε να μπορείτε να τον βρείτε, ενώ το bDNA τον φωτίζει με έναν φωτεινό προβολέα ώστε να τον βλέπετε καλύτερα. Το Project Inform είχε την καλοσύνη να μου στείλει την ακόλουθη εξήγηση του τρόπου λειτουργίας του bDNA: [9]
"Αντίγραφα ενός ανιχνευτή DNA προσαρτώνται στο τοίχωμα ενός μικρού εργαστηριακού δοχείου- στη συνέχεια, το δείγμα τοποθετείται μέσα. [Ο ανιχνευτής DNA είναι ένα μικρό κομμάτι DNA που είναι συμπληρωματικό προς την αλληλουχία DNA-στόχου]. Αυτός ο ανιχνευτής συνδέεται με ένα συγκεκριμένο τμήμα του RNA του HIV, εάν αυτό βρίσκεται στο δείγμα, συγκρατώντας το RNA στο δοχείο. Στη συνέχεια, τοποθετείται ένας άλλος ανιχνευτής DNA- το ένα άκρο αυτού προσδένεται σε ένα άλλο τμήμα του RNA του HIV. Το άλλο άκρο του δεύτερου ανιχνευτή έχει πολλές διακλαδώσεις και κάθε διακλάδωση καταλήγει σε μια χημική ουσία "ρεπόρτερ" που, υπό ορισμένες συνθήκες, θα παράγει φως, το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί από εργαστηριακό εξοπλισμό. Κάθε μόριο του HIV RNA μπορεί να προσκολληθεί σε μία από αυτές τις διακλαδώσεις και να συγκρατήσει έναν μικρό αριθμό φωτεινών πηγών, όχι μόνο μία. Με αυτόν τον τρόπο, μπορούν να ανιχνευθούν πολύ μικρές ποσότητες του RNA-στόχου, χωρίς να απαιτείται ενίσχυση με PCR".
Στην αρχική του δημοσίευση, ο Ho δεν έδωσε στοιχεία για τα πρωτόκολλα αυτής της εξέτασης ή για το κατά πόσον ήταν αξιόπιστη. Ο αναγνώστης παραπέμφθηκε σε δύο άλλες εργασίες που ήταν "υπό έκδοση". Έτσι, κανένα δεδομένο δεν ήταν διαθέσιμο εκείνη τη στιγμή σε όποιον ήθελε να επαληθεύσει αυτή τη μέθοδο. Τα δεδομένα που ελήφθησαν από το bDNA επιβεβαιώθηκαν με QC-PCR, οι λεπτομέρειες της QC-PCR καθορίζονται σε μια αναφορά που συντάχθηκε από τέσσερις συν-συγγραφείς της μελέτης Wei, που δύσκολα θα μπορούσε κανείς να αποκαλέσει ανεξάρτητους ή αντικειμενικούς ερευνητές. Σύμφωνα με την παράδοση της έρευνας για τον HIV, οι αναπόδεικτες θεωρίες και οι λανθασμένες μελέτες γίνονται αποδεκτές χωρίς αμφισβήτηση και ενσωματώνονται στη "συμβατική σοφία" πριν επικυρωθούν σωστά. Μέχρι τότε, η ζημιά έχει γίνει, και αν ανακαλυφθούν μεταγενέστερες ατέλειες, αυτό δεν έχει σχεδόν καμία σημασία.
Οι μηχανισμοί του bDNA είναι πολύπλοκοι: Λαμβάνουν χώρα πέντε διαφορετικές αντιδράσεις υβριδισμού. Ο υβριδισμός είναι μια τυπική τεχνική κατά την οποία ένας ανιχνευτής DNA τοποθετείται σε ένα δείγμα και δεσμεύεται σε κάθε συμπληρωματικό τμήμα που βρίσκει. Πρόκειται για άλλη μια έμμεση εξέταση και έχει πολλά προβλήματα. Σύμφωνα με τον μοριακό βιολόγο Bryan Ellison, "Η μόνη φορά που η μοριακή βιολογία λειτουργεί είναι αν καθαρίσεις πρώτα τα πράγματα. Υπάρχει πάντα η πιθανότητα διασταυρούμενων αντιδράσεων, ειδικά όταν βάζεις τους ανιχνευτές σου σε μια μεγάλη σούπα πρωτεϊνών" (που είναι ακριβώς αυτό που είναι το δείγμα αίματος-στόχου).
Ο Duesberg επεσήμανε τα εξής: Αφού έκανε τις κατάλληλες προσαρμογές στους υπολογισμούς του, ο ίδιος ο Ho διαπίστωσε αργότερα ότι περισσότεροι από 10.000 ιοί που προέκυψαν από τη δοκιμασία bDNA που χρησιμοποιήθηκε στην εργασία του στο Nature θα αντιστοιχούσαν στην πραγματικότητα σε λιγότερο από έναν μολυσματικό ιό, γεγονός που οδηγεί κάποιον να αναρωτηθεί τι είναι αυτό που πραγματικά μετράται σε αυτές τις εξετάσεις.10 Ωστόσο, αυτές οι εικασίες και οι μη επικυρωμένες εργασίες έχουν γίνει αποδεκτές ως ευαγγελική αλήθεια!
Κατά τον Ellison, η μελέτη του Ho είναι "καθαρή φαντασία. Δεν έχει υπάρξει ποτέ μελέτη που να δείχνει το ιϊκό φορτίο".
Τα Προβλήματα με την PCR
1. Η ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΤΗΣ PCR ΔΕΝ ΕΧΕΙ ΠΟΤΕ ΕΠΑΛΗΘΕΥΤΕΙ ΑΠΟ ΕΝΑ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟ ΧΡΥΣΟ ΠΡΟΤΥΠΟ
Για να διαπιστωθεί αν οποιαδήποτε διαγνωστική εξέταση για τη λοίμωξη από τον ιό HIV λειτουργεί πραγματικά, είναι απαραίτητο να επαληθευτεί η εξέταση με ένα ανεξάρτητο χρυσό πρότυπο. Το μόνο κατάλληλο χρυσό πρότυπο για το σκοπό αυτό είναι ο ίδιος ο HIV. Με άλλα λόγια, τα αποτελέσματα της πειραματικής σας δοκιμής, είτε πρόκειται για PCR είτε για οτιδήποτε άλλο, πρέπει να συγκρίνονται με τα αποτελέσματα της απομόνωσης του ιού σε κάθε δείγμα που εξετάζεται. Εάν όντως βρεθεί ιός σε κάθε ασθενή με θετική PCR και δεν βρεθεί ιός σε κάθε ασθενή με αρνητική PCR, τότε θα μπορούσατε να πείτε ότι η PCR είναι εξαιρετικά ακριβής για την ανίχνευση του HIV.
Η έννοια της απομόνωσης του ιού (virus isolation) ως χρυσού προτύπου είναι ιδιαίτερα σημαντική στην περίπτωση του HIV, δεδομένου ότι ο HIV ήταν εξαιρετικά δύσκολο, αν όχι αδύνατο, να οριστεί με γενετικούς ή μοριακούς όρους. Ακόμη και αν κάποιος είχε ποτέ επιτύχει την απομόνωση του ιού για τον HIV11 , δεν έχει χρησιμοποιηθεί ποτέ ως χρυσός κανόνας για οποιαδήποτε διαγνωστική εξέταση για τον HIV, συμπεριλαμβανομένης της PCR. Όπως έχει διαμορφωθεί αυτή τη στιγμή, το bDNA χρησιμοποιεί την QC-PCR ως χρυσό πρότυπο- η QC-PCR χρησιμοποιεί την κανονική PCR ως χρυσό πρότυπο- η κανονική PCR χρησιμοποιεί τις εξετάσεις αντισωμάτων ως χρυσό πρότυπο και οι εξετάσεις αντισωμάτων χρησιμοποιούν η μία την άλλη. Έχω παρατηρήσει επανειλημμένα ότι οι μελέτες που "επαληθεύουν" ένα τεστ αντισωμάτων για τον HIV δηλώνουν πάντα ότι αξιολόγησαν την απόδοση του τεστ τους σε δείγματα που ήταν γνωστό ότι ήταν ΑΛΗΘΙΝΑ-ΘΕΤΙΚΑ ή ΑΛΗΘΙΝΑ-ΑΡΝΗΤΙΚΑ. Πώς το γνώριζαν αυτό; Είναι απλό: Χωρίς χρυσό πρότυπο, δεν το ήξεραν.
Ορισμένες φορές υποστηρίζεται ότι "μελέτες έχουν δείξει" ότι αυτές οι δοκιμές συμφωνούν μεταξύ τους ή επιβεβαιώνουν τα ευρήματα η μία της άλλης, και επομένως πρέπει να είναι σωστές. Αυτό δεν είναι αυστηρή επιστημονική σκέψη. Μερικές φορές μπορείτε να πετύχετε τα αποτελέσματα διαφορετικών δοκιμών να συμφωνούν μεταξύ τους, αλλά αυτό δεν αποδεικνύει τίποτα - ούτε περισσότερο από ό,τι θα αποδείκνυε αν πέντε εγκληματίες συμφωνούσαν όλοι ότι βρίσκονταν κάπου αλλού όταν γινόταν η ληστεία της τράπεζας.
Η Eleopulos αναφέρει τα εξής σχετικά με τη σημασία των χρυσών προτύπων:
"Η χρήση της απομόνωσης του ιού ως ανεξάρτητου μέσου για την εξακρίβωση της παρουσίας ή απουσίας του ιού είναι τεχνικά γνωστή ως χρυσό πρότυπο και αποτελεί βασικό στοιχείο για την πιστοποίηση της αυθεντικότητας κάθε διαγνωστικής εξέτασης. Χωρίς ένα χρυσό πρότυπο, ο ερευνητής είναι απελπιστικά αποπροσανατολισμένος, αφού δεν έχει ένα αυτόνομο μέτρο σύγκρισης με το οποίο να μπορεί να αξιολογήσει τη δοκιμασία που φιλοδοξεί να αναπτύξει..... Μόνο με αυτόν τον τρόπο μπορούμε να διαβεβαιώσουμε τους ασθενείς ότι μια θετική HIV PCR διαπιστώνεται πάντα μόνο με την παρουσία λοίμωξης από τον ιό HIV, δηλαδή οι εξετάσεις είναι άκρως ειδικές για τη λοίμωξη από τον ιό HIV".
Ακόμη και ο γνωστός ερευνητής του AIDS William Blattner έχει παραδεχθεί ότι: "μια δυσκολία στην αξιολόγηση της ειδικότητας και της ευαισθησίας των δοκιμασιών για τους ανθρώπινους ρετροϊούς (συμπεριλαμβανομένου του HIV) είναι η απουσία ενός τελικού "χρυσού προτύπου". Ελλείψει χρυσών προτύπων τόσο για τον HTLV-1 όσο και για τον HIV-1, η πραγματική ευαισθησία και η ειδικότητα για την ανίχνευση των ιικών αντισωμάτων παραμένουν ανακριβείς " [12].
Ο Mark Craddock δηλώνει ότι η QC-PCR είναι μη επαληθευμένη και πιθανώς μη επαληθεύσιμη. Αναρωτιέται: "Εάν η PCR είναι ο μόνος τρόπος με τον οποίο μπορεί να ανιχνευθεί ο ιός, τότε πώς προσδιορίζετε το ακριβές ιϊκό φορτίο ανεξάρτητα από την PCR, ώστε να είστε βέβαιοι ότι τα στοιχεία που δίνει η PCR είναι σωστά;".
Όλα αυτά προφανώς δεν έχουν περάσει απαρατήρητα από τους ερευνητές του AIDS, καθώς συνιστάται τακτικά η PCR, ιδίως η QC-PCR, να χρησιμοποιείται ως χρυσός κανόνας για άλλες εξετάσεις HIV. [9,13]
2. Η ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ PCR ΔΕΝ ΕΧΕΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΤΕΙ ΠΟΤΕ
Ειδικότητα (specificity) σημαίνει πόσο συχνά μια εξέταση θα δώσει αρνητικά αποτελέσματα σε άτομα που δεν έχουν μολυνθεί. Η βαθμολογία εξειδίκευσης μιας εξέτασης αποκαλύπτει το επίπεδο ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων που πρέπει να περιμένουμε κατά τη χρήση της εν λόγω εξέτασης. Χωρίς ένα χρυσό πρότυπο απομόνωσης του ιού, η πραγματική ειδικότητα δεν θα είναι ποτέ γνωστή. Ακόμη και με τη χρήση της συμφωνίας με τις εξετάσεις αντισωμάτων ως χρυσό πρότυπο, η PCR δεν βρέθηκε να είναι πολύ ειδική για τον HIV. [6]
Παραθέτοντας μια μελέτη επάρκειας στην οποία συμμετείχαν πέντε εργαστήρια με εκτεταμένη εμπειρία στην PCR, ο Sloand αναφέρει ότι η μέση ειδικότητα ήταν 94,7%.[14] Η ειδικότητα ήταν τόσο χαμηλή όσο το 90%. Οι αριθμοί της δεκαετίας του 90 μπορεί να ακούγονται καλοί, αλλά στην πραγματικότητα δεν ισχύει κάτι τέτοιο. Ο αριθμός των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων σε σύγκριση με τα πραγματικά θετικά αποτελέσματα εξαρτάται από τον επιπολασμό της λοίμωξης HIV σε κάθε πληθυσμό που εξετάζεται15 - όσο χαμηλότερος είναι ο επιπολασμός, τόσο περισσότερα ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
Ο Sloand σχολιάζει ότι εάν τα επίπεδα ειδικότητας που επιτεύχθηκαν σε αυτή τη μελέτη εφαρμόζονταν στον δυνητικό πληθυσμό των αιμοδοτών" (οι αιμοδότες αποτελούνται τώρα από μέλη του γενικού πληθυσμού με χαμηλό επιπολασμό), τότε: "...για κάθε πραγματική σιωπηρή λοίμωξη που ανιχνεύεται, 1.800 μη μολυσμένοι αιμοδότες θα ταξινομούνταν ως θετικοί με PCR και 3.500 ως απροσδιόριστοι με PCR. Συνεπώς, η PCR είναι σαφώς ακατάλληλη για τον έλεγχο ρουτίνας του μεταγγιζόμενου αίματος" και, κατά συνέπεια, οποιουδήποτε πληθυσμού χαμηλού επιπολασμού. Με ειδικότητα 90%, θα έλεγα ότι δεν είναι κατάλληλη για τον έλεγχο οποιουδήποτε πληθυσμού.
Σε ένα FAX που έλαβα από τα Κέντρα Ελέγχου Ασθενειών (CDC) το 1994 σχετικά με την PCR, ανέφεραν ότι: "ούτε η ειδικότητά της ούτε η ευαισθησία της είναι γνωστή" και ότι: "η PCR δεν συνιστάται και δεν έχει λάβει άδεια για διαγνωστικούς σκοπούς ρουτίνας" [16].
Με λίγα λόγια, "Η ειδικότητα οποιασδήποτε μορφής PCR, για το γονιδίωμα του HIV, δεν έχει προσδιοριστεί " [5].
3. ΟΙ ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ PCR ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΕΙΔΙΚΟΙ
Σύμφωνα με τους Eleopulos, Turner και Papadimitriou, "Η ελάχιστη προϋπόθεση για [την ερμηνεία ότι ένα θετικό σήμα PCR, ή υβριδισμού εν γένει, αποδεικνύει μόλυνση από τον HIV] είναι η προηγούμενη απόδειξη ότι οι εκκινητές PCR και οι ανιχνευτές υβριδισμού ανήκουν σε έναν μοναδικό ρετροϊό, τον HIV, και ότι οι αντιδράσεις PCR και υβριδισμού είναι ειδικές για τον HIV".
Ο Turner μου είπε ότι: "Τα γονιδιωματικά επιχειρήματα της PCR απαιτούν την απομόνωση του HIV ως απολύτως απαραίτητη. Διαφορετικά πώς γνωρίζει κανείς την προέλευση του νουκλεϊκού οξέος ;".
Η Eleopulos αμφισβητεί την πραγματικότητα ενός ξεχωριστού γονιδιώματος του HIV. Παραδεχόμενη την ύπαρξή του για χάρη της επιχειρηματολογίας, προσφέρει τα ακόλουθα στοιχεία για να αποδείξει ότι η PCR δεν είναι ειδική για τον HIV: [17]
Δεν υπάρχει κανένας τρόπος να είμαστε σίγουροι ότι οι ανιχνευτές νουκλεϊκού οξέος "HIV" και οι εκκινητές PCR είναι ειδικοί για τον HIV, διότι: οι περισσότεροι, αν όχι όλοι, οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται για τις δοκιμές υβριδισμού, συμπεριλαμβανομένων των ανιχνευτών και των εκκινητών PCR, λαμβάνονται από τον "HIV" που αναπτύσσεται σε καλλιέργειες ιστών με τη χρήση κυττάρων (που ονομάζονται κυτταρική γραμμή) που λαμβάνονται από ασθενή με λευχαιμία Τ4 κυττάρων, μια ασθένεια που ο Γκάλο ισχυρίζεται ότι προκαλείται από έναν ρετροϊό παρόμοιο με τον HIV - τον HTLV-I. Και πρόσφατα υποστηρίζεται ότι ένας ρετροϊός απομονώθηκε από μια καλλιέργεια κυττάρων που δεν έχουν μολυνθεί από τον HIV χρησιμοποιώντας μια άλλη κυτταρική σειρά. Έτσι, οι τυπικές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη του HIV έχουν αποδειχθεί ότι υποδεικνύουν άλλους ρετροϊούς. Δεδομένου ότι ακόμη και η καθιερωμένη μέθοδος για την απομόνωση ρετροϊών (η οποία μέχρι σήμερα δεν έχει γίνει ποτέ για τον HIV) δεν μπορεί να διακρίνει έναν ρετροϊό από έναν άλλο, δεν μπορεί κανείς να είναι βέβαιος ότι οι ανιχνευτές νουκλεϊκών οξέων "HIV" και οι εκκινητές PCR είναι πράγματι ειδικοί για τον HIV.
Τα προτεινόμενα γονίδια του HIV υβριδοποιούνται με τα δομικά γονίδια των HTLV-I και HTLV-II, δύο άλλων ανθρώπινων ρετροϊών. Αυτό σημαίνει ότι αν οι ανιχνευτές βρουν γενετικό υλικό από αυτούς τους άλλους ρετροϊούς, θα κολλήσουν σε αυτό και θα δώσουν σήμα ότι έχουν βρει τον HIV αντί για αυτόν. Δεδομένου ότι είναι αποδεκτό ότι το 10% των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με AIDS φέρουν τον HTLV-I και ότι το φυσιολογικό ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει αλληλουχίες που σχετίζονται με τους HTLV-I και HTLV-II, αυτού του είδους η διασταυρούμενη αντίδραση μπορεί να αναμένεται.
Τα φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα περιέχουν εκατοντάδες ή χιλιάδες αλληλουχίες που μοιάζουν με ρετροϊούς, δηλαδή μικρά τμήματα DNA που ταιριάζουν με ένα μικρό μέρος του προτεινόμενου γονιδιώματος του HIV ή άλλων ρετροϊών. Και, δεδομένου ότι η PCR συχνά ενισχύει μόνο ένα μικρό μέρος ολόκληρου του γονιδιώματος αυτού που αναζητά, πώς ξέρετε ότι αυτό που βρίσκει δεν είναι μια φυσιολογική κυτταρική αλληλουχία γονιδίων που απλώς τυχαίνει να ταιριάζει με μέρος αυτού που προτείνεται για τον HIV;
Περαιτέρω απόδειξη ότι η PCR είναι μη ειδική είναι ότι θετικές PCR μπορούν να ληφθούν από κύτταρα χωρίς νουκλεϊκά οξέα. Έτσι, αν δεν υπάρχει νουκλεϊκό οξύ, δεν υπάρχει DNA ή RNA, και αν δεν υπάρχει DNA ή RNA, σίγουρα δεν υπάρχει HIV.
Οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια για την προετοιμασία των καλλιεργειών ιστών (που ονομάζονται ρυθμιστικά διαλύματα και αντιδραστήρια) μπορεί να δώσουν θετικά σήματα PCR για τον HIV.[18]
4. Η PCR ΑΝΙΧΝΕΥΕΙ ΜΟΝΟΝ ΕΝΑ ΜΙΚΡΟ ΘΡΑΥΣΜΑ ΕΝΟΣ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΙΟΥ
Η PCR ανιχνεύει στην καλύτερη περίπτωση μεμονωμένα γονίδια και τις περισσότερες φορές μόνο κομμάτια γονιδίων. Εάν η PCR βρει δύο ή τρία γενετικά θραύσματα από μια πιθανή δωδεκάδα πλήρων γονιδίων, αυτό δεν αποτελεί απόδειξη ότι υπάρχουν όλα τα γονίδια (ολόκληρο το γονιδίωμα). Το μέρος ενός γονιδίου δεν ισοδυναμεί με ένα πλήρες σωματίδιο ιού.
Οι ειδικοί του HIV παραδέχονται ότι η πλειονότητα των προτεινόμενων γονιδιωμάτων του HIV είναι ελλιπή- δεν θα μπορούσαν ποτέ να ενορχηστρώσουν τη σύνθεση ενός σωματιδίου του ιού.
Ο Turner εξηγεί: "Ακόμη και αν όλα τα γονιδιώματα ήταν πλήρη, το να έχεις τα σχέδια δεν σημαίνει ότι έχεις χτίσει το σπίτι. Μπορείς να κουβαλάς ένα ολόκληρο ρετροϊικό γονιδίωμα μέσα στα κύτταρά σου σε όλη σου τη ζωή χωρίς ποτέ να δημιουργήσεις ένα σωματίδιο ιού".
Αυτά τα δύο προβλήματα καθιστούν ακόμη πιο αβέβαιο το ποια είναι η σημασία μιας θετικής PCR.
5. Η ΑΝΕΥΡΕΣΗ "HIV RNA" ΣΤΗΝ PCR ΔΕΝ ΣΗΜΑΙΝΕΙ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΤΟΥ ΙΟΥ HIV
Στις μέρες μας ακούει κανείς συνεχώς τη φράση "HIV RNA PCR". Ποια είναι η διαφορά μεταξύ αυτής και της κανονικής παλιάς PCR DNA; Η κανονική PCR αναζητά την έκδοση DNA αυτού που συχνά γίνεται αποδεκτό ότι είναι το γονιδίωμα του HIV- η RNA PCR αναζητά την έκδοση RNA, δηλαδή τον ελεύθερο ιό που δεν έχει μολύνει ένα κύτταρο.
Με τη νέα αντίληψη ότι ο HIV πολλαπλασιάζεται κατά δισεκατομμύρια, θεωρήθηκε πλέον απαραίτητο να βρεθεί πόσος ελεύθερος ιός μπορεί να υπάρχει ανά πάσα στιγμή. Ο ελεύθερος ιός θα περιείχε μόνο RNA, οπότε αν η PCR βρει πολύ "HIV RNA", πιστεύεται ότι δισεκατομμύρια αντίγραφα του ελεύθερου ιού περιφέρονται στους ιστούς του ασθενούς. Με άλλα λόγια, αν βρείτε RNA, έχετε βρει και τον HIV. Δεδομένου ότι πιστεύεται ότι ο HIV περιέχει δύο αλυσίδες RNA, ο προτεινόμενος τύπος είναι ο εξής: Δύο RNA = ένας ιός.
Στην πραγματικότητα, τα πράγματα δεν είναι τόσο απλά. Το 1993, κατά τη διάρκεια της φάσης "ο HIV κρύβεται στους λεμφαδένες" της θεωρίας του ιϊκού φορτίου, ο Piatak και οι συνάδελφοί του, συμπεριλαμβανομένου του Shaw, παραδέχθηκαν ότι για να προσδιοριστεί η ποσότητα των σωματιδίων του HIV, πρέπει να υπάρχουν προηγούμενες αποδείξεις ότι το RNA ανήκει πράγματι σε ένα σωματίδιο του HIV5 . Καμία σχέση δεν έχει ακόμη τεκμηριωθεί μεταξύ της ποσότητας του RNA και της ποσότητας των σωματιδίων που μπορεί να υπάρχουν ή να μην υπάρχουν. Και κανείς δεν έχει αποδείξει αν το RNA προέρχεται από σωματίδιο του ιού ή από κάπου αλλού.
Χωρίς την απομόνωση του ιού, πώς γνωρίζετε την προέλευση του νουκλεϊκού οξέος (RNA);
6. Ο ΙΟΣ ΧΩΡΙΣ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΜΟΛΥΣΜΑΤΙΚΟΣ ΙΟΣ
Ακόμη και αν ο Ho είχε δίκιο για την ύπαρξη δισεκατομμυρίων ελεύθερων κυττάρων HIV στην κυκλοφορία του αίματος, ο ελεύθερος ιός δεν είναι εξ ορισμού μολυσματικός ιός- είναι άσχετος ως παθογόνος. Για να μολύνει ο HIV ένα κύτταρο, η πρωτεΐνη του φακέλου του, η gp120, πρέπει να συνδεθεί με τη θέση του υποδοχέα CD4 στην επιφάνεια του κυττάρου. Ωστόσο, ήδη από το 1983, ο Gallo επεσήμανε ότι "ο ιϊκός φάκελος που απαιτείται για τη μολυσματικότητα είναι πολύ εύθραυστος. Έχει την τάση να αποκολλάται όταν ο ιός εκκολάπτεται από τα μολυσμένα κύτταρα, καθιστώντας έτσι τα σωματίδια ανίκανα να μολύνουν νέα κύτταρα". Εξαιτίας αυτού, ο Gallo είπε ότι: "η επαφή από κύτταρο σε κύτταρο μπορεί να απαιτείται" για τη ρετροϊική μόλυνση. Δεδομένου ότι η gp120 είναι "ζωτικής σημασίας για την ικανότητα του HlV να μολύνει νέα κύτταρα" και δεδομένου ότι η gp120 δεν βρίσκεται στα ελεύθερα από κύτταρα σωματίδια, ακόμη και αν υπάρχουν τεράστιες ποσότητες ελεύθερου HIV στο αίμα, αυτές θα ήταν μη μολυσματικές. [17]
7. Η PCR ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ Ή ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΜΗ
Σε μια πρόσφατη δημοσίευση, οι Teo και Shaunak σχολίασαν για την in situ PCR:
"Παρά τις σημαντικές προσπάθειες, η τεχνική εξακολουθεί να είναι τεχνικά δύσκολη και δεν έχει ακόμη αποδειχθεί αξιόπιστη ή αναπαραγώγιμη". [19]
Σε μια μελέτη στην οποία συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα της PCR με τα αποτελέσματα των εξετάσεων αντισωμάτων, διαπιστώθηκε ότι η PCR δεν ήταν αναπαραγώγιμη και ότι: "παρατηρήθηκαν ψευδώς θετικά και ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα σε όλα τα εργαστήρια (η συμφωνία με τις εξετάσεις αντισωμάτων κυμαινόταν από 40% έως 100%)". [20]
8. Η PCR ΕΙΝΑΙ ΕΠΙΡΡΕΠΗΣ ΣΕ ΔΙΑΣΤΑΥΡΟΥΜΕΝΗ ΜΟΛΥΝΣΗ
Μικροσκοπικές ποσότητες νουκλεϊκών οξέων από προηγούμενα δείγματα μπορούν εύκολα να επιμολύνουν το δείγμα που εξετάζεται επί του παρόντος, δίνοντας ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. [21] Ακόμη και μικροσκοπικά κομμάτια δέρματος ή μαλλιών από τον τεχνικό του εργαστηρίου μπορούν να προκαλέσουν αυτό το πρόβλημα. Υπάρχουν πολλές πηγές διασταυρούμενης μόλυνσης και μπορεί να συμβεί "σε οποιοδήποτε στάδιο της διαδικασίας, από το σημείο συλλογής των δειγμάτων μέχρι την τελική ενίσχυση... ". [22]
Άλλες αιτίες ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων απαριθμούνται από τους Teo και Shaunak: "Έχουμε πλέον εντοπίσει έναν αριθμό παραγόντων που μπορούν να συμβάλουν στην κακή ενίσχυση του DNA-στόχου και στη δημιουργία ψευδώς θετικών σημάτων. Οι παράγοντες αυτοί περιλαμβάνουν τις επιδράσεις της σταθεροποίησης, της αφαίρεσης αντιδραστηρίου, της αποδόμησης του DNA, της τελικής σήμανσης του DNA και της διάχυσης του προϊόντος..... Πιστεύουμε ότι πρέπει να επιδεικνύεται σημαντική προσοχή στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων που παράγονται με τη χρήση PCR in situ" [19].
9. ΤΑ ΨΕΥΔΩΣ ΘΕΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΜΦΑΝΙΖΟΝΤΑΙ ΣΥΧΝΑ ΜΕ ΤΗΝ PCR
Μια μελέτη επάρκειας για την αξιολόγηση της απόδοσης της PCR του HIV στην ανίχνευση DNA χωρίς κύτταρα έδειξε "ένα ανησυχητικά υψηλό ποσοστό μη ειδικής θετικότητας" με τη χρήση των συνήθως χρησιμοποιούμενων εκκινητών (SK38/39, για το γονίδιο gag ή p24). Στην πραγματικότητα, βρέθηκαν παρόμοια ποσοστά θετικότητας τόσο για δείγματα αρνητικά σε αντισώματα όσο και για δείγματα θετικά σε αντισώματα (18% έναντι 26%! [23]
Από 30 μη μολυσμένα παιδιά, 6 είχαν "περιστασιακά" θετικά αποτελέσματα PCR. [24]
Η PCR που διενεργήθηκε σε μη μολυσμένα βρέφη ηλικίας κάτω του ενός έτους έδειξε ότι 9/113 (9 από τα 113), 15/143, 13/137, 7/87 και 1/63 βρέφη είχαν θετικές εξετάσεις PCR. [25]
Μεταξύ 117 μη μολυσμένων παιδιών που γεννήθηκαν από μητέρες μολυσμένες με HIV, έξι (5%) είχαν ψευδώς θετική PCR στο αίμα του ομφάλιου λώρου. [26]
Σε μια μελέτη επάρκειας της PCR, το 54% των εργαστηρίων που συμμετείχαν είχαν προβλήματα με ψευδώς θετικά αποτελέσματα- το 9,3% του συνόλου των μη μολυσμένων δειγμάτων αναφέρθηκε ως θετικό. [22]
Ένας από τους 69 αρνητικούς σε αντισώματα, μη ορομετατροπείς ήταν θετικός στην PCR. [27]
Ένα άτομο υψηλού κινδύνου ήταν αρχικά θετικό στην PCR, αλλά αρνητικό στην επαναληπτική εξέταση PCR του ίδιου δείγματος από δύο διαφορετικά εργαστήρια. [27]
Η οµάδα εργασίας PCR του Παγκόσµιου Οργανισµού Υγείας κατέδειξε υψηλά επίπεδα ψευδώς θετικών αποτελεσµάτων που προέκυψαν κατά τη διάρκεια "τυφλών" µελετών HIV PCR. [22]
Οι Sheppard et al: "Η μελέτη αυτή κατέδειξε ότι τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα, ακόμη και με αυστηρούς αλγορίθμους ελέγχου, συμβαίνουν με επαρκή συχνότητα μεταξύ μη μολυσμένων ατόμων ώστε να παραμένουν σοβαρό πρόβλημα". [28]
Από τους 327 εργαζόμενους στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης που εκτέθηκαν με βελόνα σε HIV, 4 είχαν ένα ή περισσότερα θετικά αποτελέσματα PCR και 7 είχαν απροσδιόριστα αποτελέσματα. Τα μεταγενέστερα δείγματα και για τους 11 ήταν αρνητικά και κανένας δεν μετατράπηκε σε ορό ή δεν εμφάνισε αντιγοναιμία p24, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι "ψευδώς θετικά αποτελέσματα εμφανίζονται ακόμη και υπό τις πιο αυστηρές συνθήκες εξέτασης ". [29]
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ
Απαραίτητη για τη θεωρία του Dr. Ho είναι η ιδέα ότι ο HIV μεταλλάσσεται τόσο γρήγορα ώστε μέσα σε λίγες ημέρες ή εβδομάδες να έχει γίνει ανθεκτικός σε οποιοδήποτε "αντιϊκό" φάρμακο παίρνει ο ασθενής. Προκειμένου να αποφευχθεί αυτό, συνιστάται στον ασθενή να λαμβάνει "συνδυασμούς" τριών φαρμάκων που θεωρητικά πλήττουν τον HIV από όλες τις πλευρές ταυτόχρονα, μειώνοντας έτσι την πιθανότητα επιβίωσης ενός ανθεκτικού στελέχους. Εν τω μεταξύ, πρέπει να παρακολουθείται συνεχώς το "ιϊκό φορτίο" με εξετάσεις που κοστίζουν 200 δολάρια η μία. Η έμφαση δίνεται στην έγκαιρη παρέμβαση, δηλαδή να χορηγούνται στους ασθενείς πολυφάρμακα από τη στιγμή που θα μετατραπούν σε ορομετατροπή (υποθέτοντας ότι κάποιος θα μπορούσε να γνωρίζει πότε συνέβη αυτό το γεγονός για να ξεκινήσει) και να τους κρατάνε σε αυτά τα φάρμακα για το υπόλοιπο της ζωής τους.
Παρόλο που κανείς δεν έχει αποδείξει ότι είναι ακριβείς, οι αναλύσεις του ιϊκού φορτίου προωθούνται δυναμικά ως σύγχρονες ανάγκες για τους PWA, και δεν είναι δύσκολο να καταλάβουμε το γιατί. Στην Washington Post (2-06-96), ο David Brown αποκάλυψε κατά λάθος τον λόγο:
"Η επιθετική θεραπεία του HIV θα είναι πιθανώς ακόμη πιο ακριβή από ό,τι στο παρελθόν. Η μέτρηση του ιϊκού φορτίου θα κοστίζει περίπου 200 δολάρια ανά εξέταση, και η νέα γενιά φαρμάκων για τον HIV θα είναι πιθανότατα τουλάχιστον το ίδιο ακριβή με αυτά που αντικαθιστούν".
Το U. S. News and World Report (2-12-96) ήταν πιο συγκεκριμένο, υπολογίζοντας το ετήσιο κόστος ενός αναστολέα πρωτεάσης σε περίπου 6.000 δολάρια και το κόστος των τριπλών συνδυασμών φαρμάκων σε έως και 12.000-18.000 δολάρια. Συνδυασμοί τριών ή τεσσάρων φαρμάκων συνταγογραφούνται τώρα, ενώ παλαιότερα αρκούσε ένα (AZT). Καθώς όλο και περισσότερα φάρμακα κρίνονται απαραίτητα για τη "θεραπεία" ανθρώπων, πολλοί από τους οποίους δεν έχουν κανένα πρόβλημα, είναι προφανές πόσο μεγάλη αγελάδα μετρητών θα είναι αυτό για τη φαρμακοβιομηχανία.
Η θεωρία του ιϊκού φορτίου δημιούργησε μια νέα ανησυχία που προκαλεί αφόρητο άγχος στη ζωή απελπισμένων ανθρώπων. Λέγεται τώρα ότι ένα άτομο έχει μόνο μία ευκαιρία για τα νέα "αντι-ιϊκά" φάρμακα, κυρίως τους αναστολείς πρωτεάσης. Αν δεν τα πάρετε ακριβώς τη σωστή στιγμή, στους σωστούς ακριβώς συνδυασμούς ή ποσότητες, ή αν ανόητα πάρετε μόνο ένα φάρμακο κάθε φορά, ή αν μειώσετε τη δόση σας επειδή η τρέχουσα δόση σας αρρωσταίνει, ο ιός σας θα γίνει ανθεκτικός και τα φάρμακα δεν θα λειτουργήσουν ποτέ ξανά πάνω σας. Και δεν μπορείτε επίσης να σταματήσετε τα φάρμακα, για τον ίδιο λόγο, ακόμη και αν σας αρρωσταίνουν θανάσιμα.
Κάθε άρθρο σχετικά με το θέμα μέχρι στιγμής έχει μια διαφορετική εικασία ειδικού σχετικά με το πώς υποτίθεται ότι λειτουργεί όλο αυτό το πρόγραμμα: κανείς δεν ξέρει αν μπορείτε να θεραπευτείτε ή απλώς να κρατήσετε τη γραμμή- κανείς δεν γνωρίζει τη μακροπρόθεσμη πρόγνωση για όσους παίρνουν αυτό το τριπλό τοξικό τριπλό-συνδυασμό. (Οι αναστολείς πρωτεάσης έχουν προκαλέσει ακραίες ανεπιθύμητες αντιδράσεις σε πολλούς ανθρώπους, οπότε δεν θα πρέπει να είναι δύσκολο να το καταλάβουμε). Όποιος είναι αρκετά ανόητος για να εγγραφεί θα γίνει πειραματόζωο για ανθρώπους που δεν ξέρουν τι κάνουν.
Πότε θα σταματήσουμε να επιτρέπουμε στους εαυτούς μας να χρησιμοποιούνται ως πειραματόζωα για όποιο τρελό σχέδιο έρθει στο προσκήνιο; Πότε θα βάλουμε λουκέτο στο πορτοφόλι μας και θα αρνηθούμε να πληρώσουμε για το προνόμιο να μας δηλητηριάζουν; Και πότε θα σταματήσουμε να υποστηρίζουμε τα πιο υποβαθμισμένα ανθρώπινα όντα που υπάρχουν - αυτούς που επωφελούνται από τον πόνο των άλλων;
***************
ΑΝΑΦΟΡΕΣ
1. Embretson J, Zupancicl M, Ribas JL, et al. 1992. “Massive covert infection of helper T lymphocytes and macrophages by HIV during the incubation period of AIDS.” Nature. 362:359-362.
2. Pantaleo G, Graziosi C, Demarest J, et al. 1993. “HIV infection is active and progressive in lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease.” Nature. 362:355-358.
3. Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, et al. 1995. “Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection.” Nature. 373:123-126.
4. Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, et al. 1995. “Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection.” Nature. 373:117-122.
5. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J. 1995. “Turnover of HIV-1 and CD4 lymphocytes.” Reappraising AIDS. 3(6):2-4.
6. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J. Letter to Nature. 1994. “Is HIV really hiding in the Iymph nodes?”
7. Duesberg P, Bialy H. “Responding to ‘Duesberg and the new view of HIV”’ in AIDS: Virus- or Drug-Induced. Kluwer Academic Publishers, Boston (1996).
8. Craddock M. 1995. “HIV: Science by Press Conference.” Reappraising AIDS. 3(5):-4.
9. Project Inform Fact Sheet: PCR Tests. August 1, 1995.
10. Duesberg P, Bialy H. 1995. “HIV an illusion.” Nature. 375:197.
11. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF and Papadimitriou JM. 1993. “Is a positive Western Blot proof of HIV infection?” Bio/Technology. 11:696-707.
12. Blattner WA. 1989. Retroviruses. pp545-592. In Viral Infections in Humans, third edition, edited by A Evans. Plenum Medical Book Company, New York.
13. Macy E, Adelman D. 1988. Letter to New England Journal of Medicine. December 15.
14. Sloand E, Pitt E, Chiarello R, et al. 1991. “HIV Testing: State of the art.” JAMA. 266:2861.
15. Maver, Robert. April 1993. “Testing AIDS Tests.” Rethinking AIDS. 1(4):4.
16. Centers for Disease Control Faxback document #320320, January 1993.
17. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J, Causer D. 1995. “Factor Vlll, HIV, and AIDS in hemophiliacs: An analysis of their relationship.” Genetica. 95(1-3):25-50.
18. Conway B. 1990. “Detection of HIV-1 by PCR in Clinical Specimens,” p40-45, in Techniques in HIV Research, edited by A Aldovini and BD Walker, MacMillan, New York.
19. Teo IA, Shaunak S. 1995. “PCR in situ: aspects which reduce amplification and generate false-positive results.” Histochem. J. 27:660.
20. Defer C, Agut H, Garbarg-Chenon A, et al. 1992. “Multicentre quality control of polymerase chain reaction for detection of HIV DNA.” AIDS. 6:659.
21. Bootman JS, Kitchin PA. 1994. “Reference preparations in the standardization of HIV-1 PCR: An international collaborative study.” J. Vir. Meth. 49:1-8.
22. Bootman JS, Kitchin PA. 1992. “An international collaborative study to assess a set of reference reagents for HIV-1 PCR.” J. Vir. Meth. 37:23.
23. Busch MP, Henrard DR, Hewlett IK, et al. 1992. “Poor sensitivity, specificity, and reproducibility of detection of HIV-1 DNA in serum by polymerase chain reaction.” J. AIDS. 5:872.
24. Garbarg-Chenon A, Segondy M, Conge A, et al. 1993. “Virus isolation, polymerase chain reaction and in vitro antibody production for the diagnosis of pediatric human immunodeficiency virus infection.” J. Vir. Methods. 42:117.
25. Paui MO, Tetali S, Lesser ML, et al. 1996. “Laboratory diagnosis of infection status in infants perinatally exposed to human immunodeficiency virus type 1.” J. Inf. Dis. 173:68.
26. Simonon A, Lepage P, Karita E, et al. 1994. “An assessment of the timing of mother-to-child transmission of human immunodeficiency virus type 1 by means of polymerase chain reaction.” J. AIDS. 7:952.
27. Celum CL, Coombs RW, Lafferty W, et al. 1991. “Indeterminate human immunodeficiency virus type 1 Western Blots: Seroconversion risk, specificity of supplemental tests, and an algorithm for evaluation.” J. Inf. Dis. 164:656.
28. Sheppard HW, Ascher MS, Busch MP, et al. 1991. “A multicenter proficiency trial of gene amplification (PCR) for the detection of HIV-1.” J. AIDS. 4:277.
29. Gerberding JL. 1994. “Incidence and prevalence of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, and cytomegalovirus among health care personnel at risk for blood exposure: Final report from a longitudinal study.” J. Inf. Dis. 170:1410.
Με ευχαριστίες προς:
Τον Paul Philpott, πρώην βοηθό έρευνας στην ανοσολογία και νυν συντάκτη του Reappraising AIDS- και Todd Miller, διδάκτορα βιοχημείας και μοριακής βιολογίας, του Πανεπιστημίου του Μαϊάμι.
Μια παρόμοια έκδοση αυτού του άρθρου πρωτοεμφανίστηκε στο HEAL/New York Bulletin, Οκτώβριος 1996.
----Δικτυογραφία :
Viral Load and the PCR -why they can't be used to prove HIV infection