ΦΑΚΕΛΛΟΣ "ΙΟΛΟΓΙΑ": Μόλυνση και Περιορισμοί της PCR
Μετάφραση: Απολλόδωρος
17 Φεβρουαρίου 2022 | Mike Stone, ViroLIEgy | Διαβάστε το εδώ
"Η αλληλουχία του γονιδιώματος αυτού του ιού, καθώς και οι άκρες του, προσδιορίστηκαν και επιβεβαιώθηκαν με αντίστροφη μεταγραφική PCR (RT-PCR)10 και ταχεία ενίσχυση των άκρων του cDNA 5′/3′ (RACE), αντίστοιχα."
Το παραπάνω τμήμα προέρχεται από την αρχική μελέτη που υποστηρίζει τη δημιουργία του γονιδιώματος "SARS-COV-2". Όπως φαίνεται, η αλληλουχία και τα άκρα προσδιορίστηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με αντίστροφη μεταγραφή, γνωστή και ως RT-PCR. Έχω ασχοληθεί με την PCR αρκετές φορές κατά τη διάρκεια αυτής της Πανδημίας Δοκιμών, καθώς είναι ο κινητήριος μοχλός που κινεί αυτή την απάτη. Χωρίς PCR, δεν θα υπήρχε γονιδίωμα. Χωρίς το γονιδίωμα, δεν θα υπήρχε διαγνωστικό τεστ PCR. Χωρίς το τεστ, δεν θα υπήρχαν κρούσματα και συνεπώς δεν θα υπήρχε "πανδημία". Παρόλα αυτά, οι άνθρωποι με κάποιο τρόπο αδυνατούν να δουν τα εγγενή προβλήματα που περιβάλλουν αυτό το μηχάνημα Xerox DNA που έχει μετατραπεί σε ελαττωματικό διαγνωστικό τεστ και χρησιμοποιείται για να χαρακτηρίσει κάποιον θετικό για ανύπαρκτους "ιούς". Αποτυγχάνουν να κατανοήσουν τι είναι η PCR και γιατί δεν είναι κατάλληλη ως διαγνωστική εξέταση. Αποτυγχάνουν να κατανοήσουν ότι η τεχνική αυτή έχει διάφορους περιορισμούς και είναι επιρρεπής σε επιμολύνσεις.
Για να ξεκαθαρίσουμε λίγο τα πράγματα, ας πάρουμε πρώτα μερικές πληροφορίες για το τι ακριβώς είναι η PCR:
"Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία πολλαπλών αντιγράφων ενός τμήματος DNA. Η PCR είναι πολύ ακριβής και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση ή την αντιγραφή ενός συγκεκριμένου στόχου DNA από ένα μείγμα μορίων DNA. Αρχικά, σχεδιάζονται δύο σύντομες αλληλουχίες DNA που ονομάζονται εκκινητές για να συνδέονται με την αρχή και το τέλος του στόχου DNA. Στη συνέχεια, για την εκτέλεση της PCR, το πρότυπο DNA που περιέχει τον στόχο προστίθεται σε ένα σωληνάριο που περιέχει εκκινητές, ελεύθερα νουκλεοτίδια και ένα ένζυμο που ονομάζεται DNA πολυμεράση και το μείγμα τοποθετείται σε μια μηχανή PCR. Η μηχανή PCR αυξάνει και μειώνει τη θερμοκρασία του δείγματος με αυτόματα, προγραμματισμένα βήματα. Αρχικά, το μείγμα θερμαίνεται για να μετουσιωθεί ή να διαχωριστεί το δίκλωνο πρότυπο DNA σε μονόκλωνες αλυσίδες. Στη συνέχεια, το μείγμα ψύχεται έτσι ώστε οι εκκινητές να συνδεθούν ή να προσδεθούν στο πρότυπο DNA. Σε αυτό το σημείο, η DNA πολυμεράση αρχίζει να συνθέτει νέες αλυσίδες DNA ξεκινώντας από τους εκκινητές. Μετά τη σύνθεση και στο τέλος του πρώτου κύκλου, κάθε δίκλωνο μόριο DNA αποτελείται από μία νέα και μία παλιά αλυσίδα DNA. Στη συνέχεια, η PCR συνεχίζεται με πρόσθετους κύκλους που επαναλαμβάνουν τα προαναφερθέντα βήματα. Τα νεοσυντιθέμενα τμήματα DNA χρησιμεύουν ως πρότυπα σε μεταγενέστερους κύκλους, οι οποίοι επιτρέπουν την εκθετική ενίσχυση του στόχου DNA εκατομμύρια φορές".
https://www.nature.com/scitable/definition/polymerase-chain-reaction-pcr-110/
Όπως ανέφερα προηγουμένως και όπως η παραπάνω ενότητα πρέπει να καταστήσει απολύτως σαφές, η PCR είναι απλώς μια ακριβή μηχανή φωτοτυπίας DNA. Αυτό είναι το μόνο που είναι. Τίποτα περισσότερο, τίποτα λιγότερο. Δημιουργεί συνθετικά αντίγραφα του DNA μέσω πολυάριθμων κύκλων με τη χρήση διαφόρων χημικών ουσιών. Υπάρχουν πολλά προβλήματα με την (κακή) χρήση ενός δοξασμένου αντιγραφικού μηχανήματος ως διαγνωστικού τεστ για έναν ανύπαρκτο "ιό", όπως η έλλειψη τυποποιημένων τιμών Ct και τοαίνιγμα του επιπολασμού.
και το Υπάρχουν πολλαπλοί παράγοντες που μπορούν να συμβάλουν στη μεταβλητότητα και την αναξιοπιστία των τιμών Ct της PCR και συνεπώς των αποτελεσμάτων οποιασδήποτε διαγνωστικής εξέτασης, όπως:
Η χρήση διαφορετικών συσκευών συλλογής δειγμάτων
Τύποι δειγμάτων
Μέθοδοι εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων
Γονιδιωματικοί στόχοι
Χημικές μεθόδους PCR πραγματικού χρόνου
Η ποικιλία των μεθόδων εξέτασης
Η έλλειψη καθολικά εφαρμόσιμων τιμών Ct
Ουσιαστικά, όλοι αυτοί οι παράγοντες καθιστούν τα αποτελέσματα των διαγνωστικών δοκιμών PCR εντελώς ανούσια. Ωστόσο, πέρα από τους περιορισμούς της PCR ως διαγνωστικού εργαλείου, υπάρχουν επίσης ορισμένα πολύ ανησυχητικά μειονεκτήματα για την PCR ως εργαστηριακή τεχνική, τα οποία σχετίζονται κυρίως με τη μόλυνση, όπως θα δείτε κατά τη διάρκεια των επόμενων πηγών.
Αρχικά, τα κυριότερα σημεία αυτής της πρώτης πηγής εξηγούν ότι, αν και προσπαθούν να την μετριάσουν, η μόλυνση στην PCR είναι αναπόφευκτη. Με την ταχεία αύξηση της τεχνολογίας, όπως η NGS, τα ζητήματα μόλυνσης έχουν γίνει ακόμη πιο έντονα. Ο συγγραφέας μοιράζεται παραδείγματα για το πώς η επιμόλυνση παρεισέφρησε σε "ιογενή" και αρχαία βακτηριακά παθογόνα, καθώς και στην αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος μιας αγελάδας. Αυτό οφείλεται κυρίως στη διαδικασία ενίσχυσης μέσω της PCR, όπου δημιουργούνται αντίγραφα του DNA εκθετικά. Ο συγγραφέας ζητά να δοθεί έμφαση στον ποιοτικό έλεγχο και την επικύρωση, ενώ δηλώνει ότι πρέπει να υπάρξει καλύτερη ανίχνευση καθώς και καθορισμός ορίων για το φιλτράρισμα της μόλυνσης σε μελέτες όπως η μεταγονιδιωματική:
Επιλογή των συντακτών: Η Μόλυνση ήταν πάντα το πρόβλημα!
"Στα μέσα της δεκαετίας του 1980, άκουσα έναν καθηγητή υψηλού προφίλ να κάνει ένα σχόλιο μετά από μια διάλεξη σχετικά με μια ολοκαίνουργια τεχνική, την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Το σχόλιό του ήταν γεμάτο αμφιβολίες για αυτή τη νέα τεχνολογία και το μήνυμα ήταν κάτι σαν: "δεν θα μπορέσει [η PCR] ποτέ να γίνει ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο διαγνωστικό εργαλείο λόγω της αναπόφευκτης μόλυνσης". Ωστόσο, η PCR έφερε επανάσταση στις επιστήμες της ζωής, από την ιατρική έως τη γενετική της διατήρησης, ο εφευρέτης της βραβεύτηκε με το Νόμπελ και πολλοί από εμάς έκαναν καριέρα χρησιμοποιώντας την ίδια τεχνική. Οι επιστήμονες, τα κλινικά διαγνωστικά και εγκληματολογικά εργαστήρια και άλλοι που χρησιμοποιούν την PCR έμαθαν γρήγορα να αντιμετωπίζουν τη μόλυνση και να δημιουργούν μηχανισμούς για την παρακολούθησή της. Η επιμόλυνση υπήρχε, αλλά μπορούσε να αντιμετωπιστεί με το κατάλληλο εργαστηριακό περιβάλλον, τη ροή των δειγμάτων και τον προσεκτικό πειραματικό σχεδιασμό που περιλάμβανε τον κατάλληλο χειρισμό των δειγμάτων και ένα σύνολο ελέγχων.
Τα τελευταία επτά με οκτώ χρόνια μια άλλη νέα τεχνολογία, η αλληλούχιση δεύτερης γενιάς (SGS), επίσης γνωστή ως αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) ή μαζικά παράλληλη αλληλούχιση (MPS), κερδίζει όλο και περισσότερο χώρο στα εργαστήρια και τα επιστημονικά περιοδικά. Αυτό το νέο κύμα τεχνολογιών είχε ήδη βαθιές επιπτώσεις στην ανθρώπινη γονιδιωματική, τη βιολογία του καρκίνου, τη μικροβιολογία, τις μελέτες αρχαίου DNA και τη γενετική της εγκληματολογίας. Τα μεγάλα δεδομένα είναι φανταστικά ενδιαφέροντα, πιθανώς θα αλλάξουν ριζικά τις σημερινές απόψεις στη βιολογία και αντιλαμβάνονται με νέο τρόπο τη βάση των ανθρώπινων ασθενειών.
Τα τελευταία δύο χρόνια εμφανίστηκε και πάλι η ανησυχία για τη μόλυνση, όπως συμβαίνει με κάθε τεχνική μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιεί ενίσχυση. Οι μελέτες που εξετάζονται περιβάλλουν τη χρήση της τεχνολογίας NGS στη μελέτη π.χ. σύγχρονων ιογενών [1] και αρχαίων βακτηριακών [2] παθογόνων, καθώς και δεδομένων αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος της οικόσιτης αγελάδας [3].
Το 2013, οι Xu et al.[1] δημοσίευσαν μια μελέτη αποτελούμενη από 92 οροαρνητικούς, μη Α - Ε, ασθενείς με ηπατίτιδα από το Chongqing της Κίνας. Χρησιμοποίησαν Solexa deep sequencing και διαπίστωσαν ότι και οι 10 δεξαμενές ορών είχαν ένα contig 3.780 bp, το οποίο εντοπίστηκε στη διεπιφάνεια των Parvoviridae και Circoviridae. Οι συγγραφείς ονόμασαν τον νέο ιό προσωρινά NIH-CQV. Στη μελέτη, 63 από τα 90 δείγματα ασθενών (70%) ήταν θετικά, αλλά όλα τα δείγματα από 45 υγιείς μάρτυρες ήταν αρνητικά. Οι συγγραφείς συνέστησαν περαιτέρω μελέτες, αλλά κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τα "δεδομένα τους υποδεικνύουν ότι ένας ιός που μοιάζει με τον παρβοϊό είναι ιδιαίτερα διαδεδομένος σε μια ομάδα ασθενών με ηπατίτιδα μη Α-Ε". Αυτό θα είχε μεγάλη ιατρική σημασία, δεδομένου ότι η ηπατίτιδα που δεν είναι Α-Ε είναι ελάχιστα κατανοητή και τα μολυσμένα άτομα έχουν σοβαρές επιπλοκές. Λίγο αργότερα, οι Naccache και συν. [4], έθεσαν υπό αμφισβήτηση αυτά τα ευρήματα. Ανακάλυψαν, χρησιμοποιώντας NGS, έναν ιό DNA με μεγάλη απόκλιση, ο οποίος βρισκόταν επίσης στη διεπιφάνεια μεταξύ Parvoviridae και Circoviridae, και τον ονόμασαν προσωρινά υβριδικό ιό που μοιάζει με parvovirus-like (PHV). Οι συγγραφείς ανίχνευσαν τον ιό αρχικά σε διάφορα σύνολα κλινικών δειγμάτων και όλα τα στελέχη ήταν ~ 99% πανομοιότυπα στις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων και αμινοξέων μεταξύ τους και με τον NIH-CQV. Στη συνέχεια, οι Naccache κ.ά. [4] έδειξαν ότι η πηγή αυτών των ιών ήταν μολυσμένες εμπορικές στήλες σπιν-δέσμευσης πυριτίου που χρησιμοποιήθηκαν κατά την προετοιμασία των δειγμάτων, και πρότειναν ότι η εν λόγω μόλυνση μπορεί να εξαρτάται από το χρόνο και να είναι ειδική για τη γεωγραφία. Οι Smuts et al. [5] καιZhi et al. [6] μελέτησαν επίσης τις στήλες πυριτίας από την ίδια εταιρεία και επιβεβαίωσαν τη μελέτη του Naccache [], αλλά έδειξαν ότι οι στήλες πυριτίας από ορισμένες άλλες εταιρείες δεν είχαν επιμολύνσεις. Δεδομένου ότι το διοξείδιο του πυριτίου στις περισσότερες εμπορικές στήλες περιστροφής προέρχεται από τα κυτταρικά τοιχώματα των διατόμων, οι συγγραφείς του Naccache υπέθεσαν αργότερα [7] ότι ο PHV/NIH-CQV θα μπορούσε να είναι ιός διατόμων, ενώ ο Zhi et al. υπέθεσε ότι προέρχεται από ωομύκητες [6].
Οι μελέτες αρχαίου DNA έδιναν πάντοτε έμφαση στον αυστηρό έλεγχο της μόλυνσης και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων με βάση το πλαίσιο. Υπάρχει μικρή συναίνεση σχετικά με τη συλλογή δειγμάτων και τον πειραματικό σχεδιασμό των μελετών που βασίζονται σε NGS, γεγονός που μπορεί να εισάγει ένα άλλο επίπεδο ανησυχίας. Πράγματι, η μελέτη του Campana [2] χρησιμεύει ως παράδειγμα. Προσπάθησαν να επιλύσουν την αιτία της (Μεγάλη επιδημία στο Nahautl), ενός αιμορραγικού πυρετού που σκότωσε σχεδόν τον μισό πληθυσμό το 1576 στο Μεξικό. Οι συγγραφείς χρησιμοποίησαν τις πλατφόρμες αλληλούχισης Helicos HeliScope και Illumina 2500 για μεταγονιδιωματική αλληλούχιση για να ταυτοποιήσουν το παθογόνο σε οκτώ ανθρώπινα λείψανα από μια γνωστή τοποθεσία της επιδημίας από την ισπανική αποικιοκρατία. Πήραν επίσης δείγματα του περιβάλλοντος εδάφους και τέσσερα προ-αποικιακά λείψανα για συγκριτικές μελέτες. Χωρίς τη συγκριτική δειγματοληψία, οι συγγραφείς θα μπορούσαν να έχουν αναφέρει Yersinia pestis και ρικετσιόζη ως αιτιολογικά παθογόνα, τα οποία τώρα είναι πιο πιθανό να είναι ψευδώς θετικά ευρήματα. Λόγω αυτής της παρατήρησης, οι συγγραφείς πρότειναν να χρησιμοποιούνται μέθοδοι εμπλουτισμού στόχων για την επιβεβαίωση της παρουσίας ενός παθογόνου.
Τέλος, τα γονιδιώματα θηλαστικών έχουν επίσης μελετηθεί για μικροβιακή μόλυνση. Πρόσφατα οι Merchant et al. [3] μελέτησαν τηνBos Taurus, την οικόσιτη αγελάδα, της οποίας το γονιδίωμα συναρμολογήθηκε για πρώτη φορά το 2009 από 35 εκατομμύρια αναγνώσματα αλληλούχισης Sanger και χαρτογραφήθηκε σε χρωμοσώματα. Όπως συνηθίζεται σε τέτοια έργα, μικρές περιοχές παρέμειναν μη χαρτογραφημένες και οι Merchant et al.[3] στόχευσαν αυτές τις αλληλουχίες. Χρησιμοποιώντας το σύστημα Kraken για την ταξινόμηση των μη χαρτογραφημένων contigs, εντόπισαν εκπληκτικά 173 μικρά contigs που ήταν μικροβιακής προέλευσης. Ένα από αυτά ήταν ο ιός του έρπητα των βοοειδών 6, απομόνωση Pennsylvania 47, ο οποίος είναι ένας ειδικός ιός των βοοειδών που προκαλεί διάφορες ασθένειες. Ο ιός αυτός είναι ρετροϊός και οι συγγραφείς εξέτασαν την πιθανότητα εισαγωγής του ιού στο γονιδίωμα του ξενιστή, την οποία απέκλεισαν κατά την περαιτέρω διερεύνηση. Οι πιο συνηθισμένες επιμολύνσεις ανήκαν στα Acinetobacter (29 contigs), Pseudomonas (35 contigs) και Stenotrophomonas (27 contigs). Ένα άλλο απροσδόκητο μολυσματικό contig ενδιαφέροντος ήταν 2.885 μικρά contigs, τα οποία είχαν τοποθετηθεί νωρίτερα στα χρωμοσώματα 1 έως 10, τα οποία ευθυγραμμίστηκαν με ένα βακτήριο ειδικά για τον άνθρωπο, το Neisseria gonorrhoeae, στέλεχος TCDC-NG08107. Παρόλο που αυτή η αλληλουχία είναι υποθετικά ένα πλήρες γονιδίωμα, περιείχε πολλαπλές αλληλουχίες που φάνηκε να προέρχονται από τα γονιδιώματα των αγελάδων και των προβάτων. Αυτά τα ανησυχητικά ευρήματα ανάγκασαν τη GenBank να καταστείλει προσωρινά την καταχώρηση για αυτό το γονιδίωμα.
Όλες αυτές οι αναφορές που παρουσιάστηκαν παραπάνω υποδηλώνουν ότι όταν η επιστημονική κοινότητα μεταβαίνει με ταχείς ρυθμούς από την αλληλούχιση Sanger στην επόμενη φάση (ή στις επόμενες φάσεις) της τεχνολογίας αλληλούχισης, πρέπει να τονιστεί η σημασία του ποιοτικού ελέγχου και της επικύρωσης. Η μικροβιακή επιμόλυνση δεν έχει ακόμη κατανοηθεί πλήρως, αλλά δεν αποτελεί έκπληξη ότι φαίνεται να είναι διαδεδομένη. Υπάρχει ανάγκη για σαφές περίγραμμα για την ανίχνευση και την επικύρωση νέων συστημάτων δεικτών και τον καθορισμό ορίων για το φιλτράρισμα της επιμόλυνσης σε μελέτες όπως η μεταγονιδιωματική [8]. Πράγματι, ένα τέτοιο έγγραφο που παρέχει οδηγίες προς αυτή την κατεύθυνση δημοσιεύθηκε πρόσφατα στο Investigative Genetics [9]".
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/pmc/articles/PMC4279886/
Αυτή η επόμενη πηγή περιγράφει λεπτομερώς τρεις κύριες περιοχές στις οποίες η PCR συναντά περιορισμούς: το μέγεθος του αμπλικονίου, το ποσοστό σφάλματος ενίσχυσης και η μόλυνση. Ισχυρίζεται ότι η PCR είναι επιρρεπής σε λανθασμένα αποτελέσματα λόγω επιμόλυνσης:
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Περιορισμοί της PCR
Ορισμένοι από τους περιορισμούς της PCR στη σύνθεση γονιδίων είναι οι ακόλουθοι:
Μέγεθος του αμφικονίου: Η αποτελεσματικότητα της PCR μειώνεται με την αύξηση του μεγέθους του αμπλικονίου. Το αμπλικόνιο αναφέρεται στα τμήματα ή τις αλληλουχίες DNA που ενισχύονται από την PCR. Η PCR έχει τη δυνατότητα να ενισχύει αλληλουχίες DNA έως και 3 kb, αλλά ιδανικά το μήκος πρέπει να είναι μικρότερο από 1 kb. Ο λόγος οφείλεται στη χαμηλή επεξεργαστικότητα του ενζύμου Taq πολυμεράση, το οποίο δεν έχει την ικανότητα ανάγνωσης αποδείξεων. Πολλά γονίδια, ιδίως τα ανθρώπινα γονίδια, είναι μεγαλύτερα από αυτά που μπορούν να πολλαπλασιαστούν με PCR. Πρέπει να απομονωθούν και στη συνέχεια να πολλαπλασιαστούν αλληλουχίες DNA μήκους μεγαβάσεων, πράγμα που είναι αδύνατο να επιτευχθεί με την PCR.
Ποσοστό σφάλματος κατά τον πολλαπλασιασμό: Οι DNA πολυμεράσες διαθέτουν έναν μηχανισμό δοκιμαστικής ανάγνωσης με τον οποίο διορθώνουν τα σφάλματα που διαπράττονται κατά την αντιγραφή του DNA. Η πολυμεράση Taq δεν διαθέτει μηχανισμό ανάγνωσης και δεν είναι σε θέση να διορθώσει τα σφάλματα που συμβαίνουν κατά την ενίσχυση του DNA. Το ποσοστό σφάλματος της Taq πολυμεράσης είναι 1 σφάλμα ανά 9000 νουκλεοτίδια.
Μόλυνση: Η τεχνική PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και επιρρεπής σε λανθασμένα αποτελέσματα λόγω μολυσμένου DNA. Το μολυσμένο DNA μπορεί να προέρχεται από μολυσματικούς οργανισμούς που βρίσκονται στη βιολογική πηγή, κυτταρικά υπολείμματα που μεταφέρονται με τον αέρα, προϊόντα προηγούμενων αντιδράσεων PCR. Η μόλυνση μπορεί να αποφευχθεί με τη χρήση καλής εργαστηριακής τεχνικής και τη λήψη κατάλληλων μέτρων ελέγχου".
https://www.google.com/amp/s/www.medindia.net/amp/patients/patientinfo/polymerase-chain-reaction.htm
Αυτή η τρίτη πηγή εξηγεί πώς ακόμη και ίχνη μόλυνσης μπορούν να προκαλέσουν παραπλανητικά αποτελέσματα. Προκειμένου η PCR να είναι έστω και χρήσιμη, απαιτείται προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας. Αυτό θα πρέπει να αποτελεί κόκκινο πανί για όποιον πιστεύει σε ένα γονιδίωμα "νέου ιού" που λέγεται ότι χρησιμοποιεί την PCR για τη δημιουργία του. Η πολυμεράση του DNA που χρησιμοποιείται για την PCR είναι επιρρεπής σε σφάλματα που οδηγούν σε μεταλλάξεις (δηλαδή σφάλματα) στο γονιδίωμα:
Ερευνητικές τεχνικές που γίνονται απλές: Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)
"Αν και η PCR είναι μια πολύτιμη τεχνική, έχει περιορισμούς. Επειδή η PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνική, οποιαδήποτε μορφή μόλυνσης του δείγματος ακόμη και από ίχνη DNA μπορεί να οδηγήσει σε παραπλανητικά αποτελέσματα(Bolognia et al, 2008- Smith & Osborn, 2009). Επιπλέον, προκειμένου να σχεδιαστούν εκκινητές για την PCR, απαιτούνται κάποια προηγούμενα δεδομένα αλληλουχίας. Επομένως, η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για τον προσδιορισμό της παρουσίας ή της απουσίας ενός γνωστού παθογόνου ή γονιδίου. Ένας άλλος περιορισμός είναι ότι οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την PCR μπορούν να συνδεθούν μη ειδικά με αλληλουχίες που είναι παρόμοιες, αλλά όχι εντελώς ταυτόσημες με το DNA-στόχο. Επιπλέον, λανθασμένα νουκλεοτίδια μπορεί να ενσωματωθούν στην αλληλουχία PCR από την πολυμεράση του DNA, αν και με πολύ χαμηλό ρυθμό".
ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ
Η πολυμεράση DNA που χρησιμοποιείται στην αντίδραση PCR είναι επιρρεπής σε σφάλματα και μπορεί να οδηγήσει σε μεταλλάξεις στο θραύσμα που παράγεται
Η εξειδίκευση του παραγόμενου προϊόντος PCR μπορεί να μεταβληθεί από μη ειδική πρόσδεση των εκκινητών σε άλλες παρόμοιες αλληλουχίες στο πρότυπο DNA
Για να σχεδιαστούν εκκινητές για τη δημιουργία ενός προϊόντος PCR, είναι συνήθως απαραίτητες κάποιες προηγούμενες πληροφορίες για την αλληλουχία.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/
Αυτή η τελευταία πηγή ασχολείται με την κλινική (λανθασμένη) χρήση της PCR και επαναλαμβάνει ότι απαιτείται προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας προκειμένου να παραχθεί μια αλληλουχία. Η χρήση της PCR ως κλινικού διαγνωστικού εργαλείου αμφισβητείται από τις δυσκολίες στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδίως επειδή ακόμη και ίχνη "ιικού" RNA μπορούν να προκαλέσουν θετικά αποτελέσματα που θεωρούνται κλινικά άσχετα. Είναι παραδεκτό ότι δεν είναι δυνατόν να προσδιοριστεί ένα θετικό αποτέλεσμα μιας κλινικής λοίμωξης από επιμόλυνση. Συνεπώς, τα αποτελέσματα θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή λόγω της υψηλής ευαισθησίας της PCR και της αδυναμίας της να διακρίνει μεταξύ επιμόλυνσης και αποτελεσμάτων κλινικής σημασίας:
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης: πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα
Η PCR ΈΧΕΙ ΟΡΙΣΜΕΝΟΥΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥΣ....
"Η PCR δεν είναι μόνο μια πολύ ευαίσθητη τεχνική αλλά και μια πολύ ειδική τεχνική: Οι εκκινητές είναι συνήθως άμεσα συμπληρωματικοί προς την αλληλουχία-στόχο και το DNA μπορεί να ενισχυθεί μόνο εάν το DNA-υποκινητής που ταιριάζει με τον στόχο είναι επαρκές. Στην πραγματικότητα, καθώς οι εκκινητές είναι άμεσα συμπληρωματικοί προς το DNA-στόχο, η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο εάν ο στόχος είναι ακριβώς ή στενά συνδεδεμένος με την αλληλουχία DNA του αναμενόμενου αιτιολογικού παράγοντα. Για παράδειγμα, οι εκκινητές που έχουν σχεδιαστεί για την ενίσχυση του DNA του ιού των θηλωμάτων του στόματος του σκύλου πιθανόν να μην ενισχύσουν το DNA ενός άλλου ιού των θηλωμάτων του σκύλου. Η PCR απαιτεί να υπάρχουν πληροφορίες για την αλληλουχία τουλάχιστον ενός μέρους του DNA που πρόκειται να ενισχυθεί. Η ερμηνεία της κλινικής σημασίας μιας θετικής ενίσχυσης με PCR μπορεί επίσης να αποτελέσει πρόκληση. Πράγματι, ορισμένες εξαιρετικά ευαίσθητες εμφωλευμένες PCR ανιχνεύουν ακόμη και 0,05 αντίγραφα του ιού ανά κύτταρο. Η παρουσία τέτοιων ιχνών DNA δεν υποδηλώνει παραγωγική λοίμωξη αλλά πιθανώς λανθάνουσα ή κλινικά μη σχετική λοίμωξη. Για το λόγο αυτό, πρέπει να ερμηνεύει κανείς με προσοχή ορισμένα αποτελέσματα PCR. Τέλος, η PCR δεν επιτρέπει τον εντοπισμό των νουκλεϊκών οξέων. Κατά συνέπεια, δεν είναι δυνατή η διαφοροποίηση μιας κλινικής λοίμωξης από μια επιμόλυνση. Έχει, για παράδειγμα, αποδειχθεί ότι το DNA του ιού των θηλωμάτων μπορεί να ενισχυθεί από σχεδόν κάθε δείγμα φυσιολογικού ανθρώπινου δέρματος. Ωστόσο, το ποσοστό ανίχνευσης είναι πολύ χαμηλότερο όταν αφαιρείται η κεράτινη στιβάδα αυτών των δειγμάτων. Αυτό δείχνει ότι οι περισσότεροι από αυτούς τους ιούς θηλωμάτων είναι πιθανότατα μολυσματικοί".
PCR ΑΠΌ ΤΟΝ ΠΑΓΚΟ ΣΤΟ ΚΡΕΒΒΑΤΙΌ: ΑΛΛΑ.... ΠΡΟΣΟΧΗ!
"Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η PCR είναι ένα θαυμάσιο εργαλείο για την έρευνα αλλά και για την καθημερινή διάγνωση. Θα πρέπει ωστόσο να γνωρίζει κανείς μια πιθανή παγίδα: την ευαισθησία της μεθόδου. Όπως έχει ήδη ειπωθεί, ορισμένες πολύ ευαίσθητες ρυθμίσεις PCR μπορεί να είναι σε θέση να εντοπίσουν μόλις ένα αντίγραφο του γονιδιώματος μέσα σε 100 κύτταρα! Είναι πολύ απίθανο ότι αυτοί οι λίγοι μικροοργανισμοί μπορούν να προκαλέσουν βλάβη στον ξενιστή, αλλά... η εξέταση είναι θετική! Κατά συνέπεια, τα αποτελέσματα της PCR πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Ακριβώς όπως οι ορολογικές εξετάσεις IgE που προσδιορίζουν την ευαισθητοποίηση (και όχι την αλλεργία!), η PCR προσδιορίζει τη μόλυνση, αλλά δεν λέει τίποτα για την πραγματική σχέση μεταξύ αυτής της μόλυνσης και των κλινικών συμπτωμάτων. Ας πάρουμε το παράδειγμα της λεϊσμανίασης!
Πριν από το 2000, οι περισσότεροι συγγραφείς συμφωνούσαν ότι ο επιπολασμός της νόσου ήταν από 1 έως 15% στις ενδημικές περιοχές της Ευρώπης. Αλλά, μόλις άρχισαν οι μελέτες PCR, τα δεδομένα άλλαξαν. Ήταν ξαφνικά προφανές ότι η μεγάλη πλειοψηφία, αν όχι όλοι, οι σκύλοι που ζούσαν σε ενδημικές περιοχές ήταν μολυσμένοι. Όμως μόνο μερικά από αυτά ήταν οροθετικά και ελάχιστα παρουσίαζαν κλινικά συμπτώματα! Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η PCR ΔΕΝ είναι καλή εξέταση για να εκτιμηθεί αν η λοίμωξη από λεϊσμανία εξηγεί τα κλινικά συμπτώματα ενός συγκεκριμένου σκύλου. Ο χρυσός κανόνας για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα παραμένει η ανίχνευση της ειδικής για τη λεϊσμανία IgG!"
Ενώ το παραπάνω άρθρο προσπαθεί να δικαιολογήσει γιατί τα παρακάτω παραδείγματα δεν αποτελούν περιορισμούς, συνεχίζει με την απαρίθμηση αυτών των πρόσθετων ζητημάτων:
Η PCR δεν μπορεί να ενισχύσει RNA
Η PCR ενισχύει μόνο συγκεκριμένους στόχους
Η PCR ενισχύει μόνο ένα πολύ περιορισμένο τμήμα του γονιδιώματος
Η PCR μπορεί μερικές φορές να μην είναι αρκετά ειδική
Η PCR δεν είναι ποσοτική
Δεν είναι δυνατόν να γνωρίζουμε πού βρισκόταν το DNA στο δείγμα
Συνοπτικά:
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, ή PCR, είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία πολλαπλών αντιγράφων ενός τμήματος DNA
Τα νεοσυντιθέμενα τμήματα DNA χρησιμεύουν ως πρότυπα σε μεταγενέστερους κύκλους, οι οποίοι επιτρέπουν την εκθετική ενίσχυση του στόχου DNA εκατομμύρια φορές
Στις αρχές της δεκαετίας του 1980, ένας καθηγητής με υψηλό προφίλ δήλωσε ότι "δεν μπορεί ποτέ να γίνει [η PCR] ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο διαγνωστικό εργαλείο λόγω της αναπόφευκτης μόλυνσης"
Έκτοτε, η επιμόλυνση στην PCR παραμένει, αλλά μπορεί να αντιμετωπιστεί(όχι να εξαλειφθεί) με το κατάλληλο εργαστηριακό περιβάλλον, τη ροή των δειγμάτων και τον προσεκτικό πειραματικό σχεδιασμό που περιλαμβάνει τον κατάλληλο χειρισμό των δειγμάτων και ένα σύνολο ελέγχων
Με την άνοδο της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS) τα τελευταία δύο χρόνια, η ανησυχία για τη μόλυνση εμφανίστηκε και πάλι, όπως συμβαίνει με κάθε τεχνική μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιεί ενίσχυση.
Οι μελέτες που εξετάζονται αφορούν τη χρήση της τεχνολογίας NGS για τη μελέτη π.χ. σύγχρονων "ιογενών" και αρχαίων βακτηριακών παθογόνων, καθώς και δεδομένων αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος της οικόσιτης αγελάδας.
Το 2013, οι Xu et al. δημοσίευσαν μια μελέτη αποτελούμενη από 92 οροαρνητικούς, μη Α - Ε, ασθενείς με ηπατίτιδα από το Chongqing της Κίνας
Χρησιμοποίησαν βαθιά αλληλούχιση Solexa και διαπίστωσαν ότι και οι 10 δεξαμενές ορών είχαν ένα contig 3.780 bp, το οποίο βρισκόταν στη διεπαφή των Parvoviridae και Circoviridae
Οι συγγραφείς ονόμασαν τον νέο "ιό" προσωρινά NIH-CQV.
Στη μελέτη, 63 από τα 90 δείγματα ασθενών (70%) ήταν θετικά, αλλά όλα τα δείγματα από 45 υγιείς ελέγχους ήταν αρνητικά
Οι συγγραφείς συνέστησαν περαιτέρω μελέτες, αλλά κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τα "δεδομένα τους υποδεικνύουν ότι ένας "ιός" που μοιάζει με παρβοϊό είναι ιδιαίτερα διαδεδομένος σε μια ομάδα ασθενών με ηπατίτιδα μη Α-Ε".
Αμέσως μετά, οι Naccache et al. έθεσαν υπό αμφισβήτηση αυτά τα ευρήματα
Ανακάλυψαν, χρησιμοποιώντας NGS, έναν εξαιρετικά αποκλίνοντα "ιό" DNA, ο οποίος βρισκόταν επίσης στη διεπαφή μεταξύ Parvoviridae και Circoviridae, και τον ονόμασαν προσωρινά υβριδικό "ιό" που μοιάζει με parvovirus-like (PHV)
Οι συγγραφείς εντόπισαν τον "ιό" αρχικά σε διάφορα σύνολα κλινικών δειγμάτων και όλα τα στελέχη ήταν ~ 99% πανομοιότυπα στις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων και αμινοξέων μεταξύ τους και με τον NIH-CQV
Οι Naccache κ.ά. έδειξαν στη συνέχεια ότι η πηγή αυτών των "ιών" ήταν οι μολυσμένες εμπορικές στήλες σπειροτόμησης που χρησιμοποιούνταν για την προετοιμασία των δειγμάτων και πρότειναν ότι η μόλυνση αυτή μπορεί να εξαρτάται από το χρόνο και τη γεωγραφία.
Υπάρχει μικρή συναίνεση σχετικά με τη συλλογή δειγμάτων και τον πειραματικό σχεδιασμό μελετών που βασίζονται σε NGS, γεγονός που μπορεί να εισάγει ένα άλλο επίπεδο ανησυχίας.
Οι Campana et al. προσπάθησαν να επιλύσουν την αιτία του huey cocoliztli (Μεγάλη πανούκλα στο Nahautl), ενός αιμορραγικού πυρετού που σκότωσε σχεδόν το μισό πληθυσμό το 1576 στο Μεξικό
Οι συγγραφείς χρησιμοποίησαν τις πλατφόρμες αλληλούχισης Helicos HeliScope και Illumina 2500 για μεταγονιδιωματική αλληλούχιση για να ταυτοποιήσουν το παθογόνο σε οκτώ ανθρώπινα λείψανα από μια γνωστή περιοχή της επιδημίας huey cocoliztli από την ισπανική αποικιοκρατία
Πήραν επίσης δείγματα του περιβάλλοντος εδάφους και τέσσερα προ-αποικιακά λείψανα για συγκριτικές μελέτες
Χωρίς τη συγκριτική δειγματοληψία, οι συγγραφείς θα μπορούσαν να είχαν αναφέρει ως αιτιολογικά παθογόνα τα Yersinia pestis και τη ρικέτσιωση, τα οποία τώρα αποδείχθηκαν πιο πιθανό να είναι ψευδώς θετικά ευρήματα
Οι Merchant et al. μελέτησαν το Bos Taurus, την οικόσιτη αγελάδα, το γονιδίωμα της οποίας συναρμολογήθηκε για πρώτη φορά το 2009 από 35 εκατομμύρια αλληλουχίες αλληλούχισης Sanger και χαρτογραφήθηκε σε χρωμοσώματα
Μικρές περιοχές παρέμειναν αχαρτογράφητες και οι Merchant et al. στόχευσαν αυτές τις αλληλουχίες
Με τη χρήση του συστήματος Kraken για την ταξινόμηση των μη χαρτογραφημένων contigs, εντόπισαν εκπληκτικά 173 μικρά contigs που ήταν μικροβιακής προέλευσης
Ένας από αυτούς ήταν ο "ιός" του έρπητα των βοοειδών 6, απομονωμένος από την Pennsylvania 47, ο οποίος είναι ένας "ιός" που αφορά τα βοοειδή και προκαλεί διάφορες ασθένειες.
Αυτός ο "ιός" είναι ένας "ρετροϊός" και οι συγγραφείς εξέτασαν την πιθανότητα εισαγωγής "ιού" στο γονιδίωμα του ξενιστή, την οποία απέκλεισαν κατά την περαιτέρω διερεύνηση
Οι πιο κοινές προσμίξεις ανήκαν στα Acinetobacter (29 contigs), Pseudomonas (35 contigs) και Stenotrophomonas (27 contigs)
Ένα άλλο απροσδόκητο μολυσματικό contig ενδιαφέροντος ήταν 2.885 μικρά contigs, τα οποία είχαν τοποθετηθεί προηγουμένως στα χρωμοσώματα 1 έως 10, τα οποία ευθυγραμμίστηκαν με ένα βακτήριο ειδικά για τον άνθρωπο, Neisseria gonorrhoeae, στέλεχος TCDC-NG08107
Αν και η αλληλουχία αυτή είναι υποθετικά ένα πλήρες γονιδίωμα, περιείχε πολλαπλές αλληλουχίες που φαινόταν να προέρχονται από τα γονιδιώματα αγελάδας και προβάτου
Όταν η επιστημονική κοινότητα μεταβαίνει με ταχείς ρυθμούς από την αλληλούχιση Sanger στην επόμενη φάση (ή στις επόμενες φάσεις) της τεχνολογίας αλληλούχισης, πρέπει να τονιστεί η σημασία του ποιοτικού ελέγχου και της επικύρωσης
Η μικροβιακή μόλυνση δεν έχει ακόμη κατανοηθεί πλήρως, αλλά δεν αποτελεί έκπληξη ότι φαίνεται να είναι διαδεδομένη
Υπάρχει ανάγκη για σαφές περίγραμμα για την ανίχνευση και την επικύρωση νέων συστημάτων δεικτών και τον καθορισμό ορίων για το φιλτράρισμα της επιμόλυνσης σε μελέτες όπως η μεταγονιδιωματική
Η αποτελεσματικότητα της PCR μειώνεται με την αύξηση του μεγέθους του αμπλικονίου(θραύσματα ή αλληλουχίες DNA που ενισχύονται από την PCR)
Ο λόγος οφείλεται στη χαμηλή επεξεργαστικότητα του ενζύμου Taq πολυμεράση, το οποίο δεν έχει την ικανότητα ανάγνωσης αποδείξεων
Πρέπει να απομονωθούν και στη συνέχεια να πολλαπλασιαστούν αλληλουχίες DNA μεγάλου μήκους μεγαβάσεων , πράγμα που είναι αδύνατο να επιτευχθεί με την PCR.
Η πολυμεράση Taq δεν διαθέτει μηχανισμό ανάγνωσης και δεν είναι σε θέση να διορθώσει τα σφάλματα που συμβαίνουν κατά την ενίσχυση του DNA
Το ποσοστό σφάλματος της πολυμεράσης Taq είναι 1 σφάλμα ανά 9000 νουκλεοτίδια
Η τεχνική PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και επιρρεπής σε λανθασμένα αποτελέσματα λόγω μολυσμένου DNA
Το μολυσμένο DNA μπορεί να προέρχεται από μολυσματικούς οργανισμούς που βρίσκονται στη βιολογική πηγή, κυτταρικά υπολείμματα που μεταφέρονται με τον αέρα, προϊόντα προηγούμενων αντιδράσεων PCR
Επειδή η PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνική, οποιαδήποτε μορφή μόλυνσης του δείγματος ακόμη και από ίχνη DNA μπορεί να οδηγήσει σε παραπλανητικά αποτελέσματα
Για να σχεδιαστούν εκκινητές για την PCR, απαιτούνται κάποια προηγούμενα δεδομένα αλληλουχίας, επομένως η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για τον προσδιορισμό της παρουσίας ή της απουσίας ενός γνωστού παθογόνου ή γονιδίου.
Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την PCR μπορούν να συνδεθούν μη ειδικά με αλληλουχίες που είναι παρόμοιες, αλλά όχι εντελώς ταυτόσημες με το DNA-στόχο
Λανθασμένα νουκλεοτίδια μπορούν να ενσωματωθούν στην αλληλουχία PCR από την πολυμεράση DNA
Η πολυμεράση DNA που χρησιμοποιείται στην αντίδραση PCR είναι επιρρεπής σε σφάλματα και μπορεί να οδηγήσει σε μεταλλάξεις στο τμήμα που παράγεται
Καθώς οι εκκινητές είναι άμεσα συμπληρωματικοί προς το DNA-στόχο, η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο εάν ο στόχος είναι ακριβώς ή στενά συνδεδεμένος με την αλληλουχία DNA του αναμενόμενου αιτιολογικού παράγοντα
Η PCR απαιτεί να υπάρχουν πληροφορίες για την αλληλουχία τουλάχιστον ενός μέρους του DNA που πρόκειται να ενισχυθεί.
Η ερμηνεία της κλινικής σημασίας μιας θετικής ενίσχυσης με PCR μπορεί να αποτελέσει πρόκληση
Στην πραγματικότητα, ορισμένες εξαιρετικά ευαίσθητες εμφωλευμένες PCR ανιχνεύουν ακόμη και 0,05 "ιικό" αντίγραφο ανά κύτταρο
Η παρουσία τέτοιων ιχνών DNA δεν υποδηλώνει παραγωγική λοίμωξη αλλά πιθανώς λανθάνουσα ή κλινικά μη σχετική λοίμωξη
Για το λόγο αυτό, πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή ορισμένα αποτελέσματα PCR
Η PCR δεν επιτρέπει τον εντοπισμό των νουκλεϊκών οξέων και συνεπώς δεν είναι δυνατή η διαφοροποίηση μιας κλινικής λοίμωξης από μια μόλυνση
Έχει, για παράδειγμα, αποδειχθεί ότι το DNA του ιού των θηλωμάτων μπορεί να ενισχυθεί από σχεδόν κάθε δείγμα φυσιολογικού ανθρώπινου δέρματος
Αυτό υποδηλώνει ότι οι περισσότεροι από αυτούς τους "θηλωµαϊούς" είναι πιθανώς επιµολυντές.
Θα πρέπει να γνωρίζει κανείς μια πιθανή παγίδα: την ευαισθησία της μεθόδου
Κατά συνέπεια, τα αποτελέσματα της PCR πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή
Η PCR προσδιορίζει τη "μόλυνση", αλλά δεν λέει τίποτα για την πραγματική σχέση μεταξύ αυτής της "μόλυνσης" και των κλινικών συμπτωμάτων
Ένα παράδειγμα δόθηκε με τη λεϊσμανίαση, μια ασθένεια στους σκύλους που λέγεται ότι προκαλείται από παράσιτα λεϊσμανίας που εξαπλώνονται από μύγες της άμμου
Οι περισσότεροι συγγραφείς συμφώνησαν ότι ο επιπολασμός της νόσου ήταν από 1 έως 15%.
Μόλις άρχισαν οι μελέτες PCR, τα δεδομένα άλλαξαν και ξαφνικά έγινε φανερό ότι η μεγάλη πλειοψηφία, αν όχι όλοι, οι σκύλοι που ζουν σε ενδημικές περιοχές ήταν μολυσμένοι , αλλά μόνο μερικοί από αυτούς ήταν οροθετικοί και λίγοι παρουσίαζαν κλινικά συμπτώματα.
Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η PCR ΔΕΝ είναι μια καλή εξέταση για να εκτιμηθεί αν η μόλυνση από λεϊσμανία εξηγεί τα κλινικά συμπτώματα ενός συγκεκριμένου σκύλου
Άλλοι περιορισμοί περιλαμβάνουν:
Η PCR δεν μπορεί να ενισχύσει το RNA
Η PCR ενισχύει μόνο συγκεκριμένους στόχους
Η PCR ενισχύει μόνο ένα πολύ περιορισμένο τμήμα του γονιδιώματος
Η PCR μπορεί μερικές φορές να μην είναι αρκετά ειδική
Η PCR δεν είναι ποσοτική
Δεν είναι δυνατόν να γνωρίζουμε πού βρισκόταν το DNA στο δείγμα
Η επιμόλυνση δεν αποτελεί εξαίρεση, αλλά κανόνα. Ξεκινώντας από το μη καθαρισμένο δείγμα , το οποίο τοποθετείται αμέσως σε "ιικό" μέσο μεταφοράς και υποβάλλεται τακτικά σε κυτταροκαλλιέργεια, η επιμόλυνση είναι αναπόφευκτη. Αυτό μεταφέρεται στην εκχύλιση του RNA που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία των αλληλουχιών, καθώς και στις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τον κατακερματισμό του DNA/RNA σε μικρά μεγέθη για την αλληλούχιση. Η PCR χρησιμοποιείται στη συνέχεια για την ενίσχυση των θραυσμάτων σε πολλά για τη δημιουργία της βιβλιοθήκης DNA. Δεδομένου ότι η PCR είναι πολύ ευαίσθητη και επιρρεπής σε επιμολύνσεις, με τα αποτελέσματα να διαφέρουν από μηχάνημα σε μηχάνημα, από εργαστήριο σε εργαστήριο, ακόμη και με το ίδιο δείγμα με το ίδιο μηχάνημα στο ίδιο εργαστήριο, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από αυτή την τεχνική θα πρέπει να θεωρούνται στην καλύτερη περίπτωση εξαιρετικά αμφισβητήσιμα. Δεν υπάρχει βήμα σε αυτή τη διαδικασία όπου η μόλυνση δεν γίνεται αισθητή. Η ευαισθησία της PCR σημαίνει ότι η μόλυνση αυτή ενισχύεται εκθετικά. Καθώς η PCR δεν μπορεί να διαφοροποιήσει τη μόλυνση από το DNA, οι μολύνσεις αλληλουχίζονται στο γονιδίωμα οδηγώντας σε ένα γιγαντιαίο χάος λανθασμένων, αναξιόπιστων δεδομένων και ψευδών αποτελεσμάτων. Ενώ υποστηρίζεται ότι τα αποτελέσματα της PCR πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή, όταν πρόκειται για μια τεχνική επιρρεπή στη μόλυνση, κανένα αποτέλεσμα γονιδιώματος ή διαγνωστικής εξέτασης δεν πρέπει ποτέ να είναι αξιόπιστο.
*** Δικτυογραφία:
PCR Contamination and Limitations – ViroLIEgy
https://viroliegy.com/2022/02/17/pcr-contamination-and-limitations/