Η June Almeida και οι Πρώτες Εικόνες EM (ΗΜ-Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου) του «Κορονοϊού» (1967)
Αγαπητοί αναγνώστες, σας ευχαριστώ που μοιράζεστε τα άρθρα μου! Θα εκτιμούσα ιδιαίτερα αν συμπεριλαμβάνατε τον σύνδεσμο του άρθρου κατά την αναδημοσίευση, ώστε να δίνετε τη δυνατότητα και σε άλλους να τα διαβάσουν στην πρωτογενή τους πηγή. Ευχαριστώ για την κατανόηση!
Απόδοση στα ελληνικά: Απολλόδωρος - Mike Stone | 7 Δεκεμβρίου, 2021
Μπορείτε να κάνετε εφάπαξ ή επαναλαμβανόμενες δωρεές μέσω του Ko-Fi:
Το 1967, η June Almeida παρουσίασε μια εργασία που υποτίθεται ότι έδειχνε τις πρώτες ΗΜ εικόνες (Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου) της δομής του «κορονοϊού». Οι εικόνες αυτές δημοσιεύθηκαν δύο χρόνια αφότου ο D.A. Tyrrell ανακάλυψε το στέλεχος B814 το 1965 και ένα χρόνο αφότου η Dorothy Hamre ανακάλυψε το στέλεχος 229E το 1966. Τα δείγματα που χρησιμοποίησε η Almeida για να χαρακτηρίσει τους προηγουμένως αθέατους «ιούς» δόθηκαν τόσο από τον Tyrrell όσο και από την Hamre, καθώς κανένας από τους δύο δεν είχε πράγματι απεικονίσει τους «ιούς» που είχαν ήδη αποφασίσει (υποθέσει) ότι βρίσκονταν μέσα στις καλλιέργειες οργάνων και ιστών τους. Στην εργασία αυτή, την οποία συνέγραψε με τον Tyrrell, η Almeida ισχυρίστηκε ότι χρησιμοποίησε μια νέα προσέγγιση αρνητικής χρώσης για τις εικόνες της στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε μη καθαρισμένα δείγματα προκειμένου να χαρακτηρίσει τους τρεις μη χαρακτηρισμένους «ιούς». Έτσι περιγράφεται η μέθοδός της:
Βλέποντας το SARS - η Αξιοσημείωτη Ιστορία της June Almeida
Ανάπτυξη μιας Νέας Τεχνικής Μικροσκοπίας
«Στις αρχές της καριέρας της, η Almeida εργάστηκε ως τεχνικός ηλεκτρονικής μικροσκοπίας στο Ινστιτούτο Καρκίνου του Οντάριο στον Καναδά. Εκεί ανέπτυξε μια νέα τεχνική απεικόνισης για την ανίχνευση ιών, γνωστή ως ανοσολογική ηλεκτρονική μικροσκοπία (IEM) (Almeida 2008). Η τεχνική αυτή περιλαμβάνει την ανίχνευση μορίων σε υπερδομικό επίπεδο με τη σήμανσή τους με ειδικά αντισώματα συνδεδεμένα με σωματίδια κολλοειδούς χρυσού. Όταν μια δέσμη ηλεκτρονίων συναντήσει τα σωματίδια κολλοειδούς χρυσού σε ένα αντίσωμα συνδεδεμένο με το αντιγόνο του, παράγεται μια ηλεκτρονικά πυκνή σήμανση. Η δέσμη ηλεκτρονίων σαρώνεται στη συνέχεια και η θέση της δέσμης, σε συνδυασμό με την ένταση του σήματος, χρησιμοποιείται για την παραγωγή μιας εικόνας, που αναφέρεται ως ηλεκτρονικό μικρογράφημα. Αυτό επιτρέπει την ανίχνευση και την οπτικοποίηση των σωματιδίων κολλοειδούς χρυσού και συνεπώς του μορίου-στόχου. Εάν το αντιγόνο βρίσκεται στην επιφάνεια του κυττάρου, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM), όπου η δέσμη ηλεκτρονίων διατρέχει την επιφάνεια ενός δείγματος, για την απεικόνισή του».
Ταυτοποίηση ενός Νέου Τύπου Ιού
Η ομάδα ερευνητών του Tyrrell είχε συλλέξει δείγματα ενός ιού που μοιάζει με γρίπη από έναν άρρωστο μαθητή. Ωστόσο, αντιμετώπιζαν προβλήματα στην καλλιέργεια αυτού του ιού με τη χρήση παραδοσιακών μεθόδων, γεγονός που τους οδήγησε στην υποψία ότι ίσως επρόκειτο για έναν εντελώς νέο τύπο ιού (Broklehurst 2020).
Ο Tyrrell έστειλε μερικά από αυτά τα δείγματα στην Almeida με την ελπίδα ότι θα μπορούσε να ταυτοποιήσει τον ιό χρησιμοποιώντας την τεχνική IEM. Η Almeida μπόρεσε να παράγει με επιτυχία καθαρές εικόνες του ιού και σημείωσε ότι έμοιαζε με δύο παρόμοιους ιούς που είχε απεικονίσει προηγουμένως κατά τη μελέτη της βρογχίτιδας σε κοτόπουλα και της ηπατίτιδας ποντικού (Brocklehurst 2020). Αυτές είχαν προηγουμένως απορριφθεί ως κακές εικόνες των ιών της γρίπης. Ωστόσο, οι εικόνες του ιού στα δείγματα του μαθητή σε συνδυασμό με τις εικόνες από την προηγούμενη εργασία του Almeida έπεισαν τους Almeida και Tyrrell ότι επρόκειτο στην πραγματικότητα για μια νέα οικογένεια ιών.
https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/the-remarkable-story-of-June-Almeida.html
Αγνοώντας τον μάλλον γελοίο τίτλο, καθώς το «SARS» δεν ήταν «θέμα» μέχρι το 2003, αναφέρεται ότι η Almeida δημιούργησε μια νέα τεχνική ΗΜ που απαιτούσε χρυσές ετικέτες και ειδικά αντισώματα για να αλληλεπιδράσουν και να χρωματίσουν τα σωματίδια που ήθελε να αναγνωρίσει ως «ιούς». Ωστόσο, χωρίς προηγουμένως να έχει καθαρίσει, απομονώσει και χαρακτηρίσει τον «ιό», θα ήταν αδύνατο να γνωρίζει ποια αντισώματα είναι ειδικά γι' αυτόν. Συν τοις άλλοις, τα αντισώματα είναι, αντίθετα με τη δημοφιλή πεποίθηση, τακτικά μη ειδικά και προσδένονται σε ανεπιθύμητους στόχους. Όπως και οι «ιοί», δεν έχουν ποτέ καθαριστεί/απομονωθεί σωστά, χαρακτηριστεί και αποδειχθεί ότι υπάρχουν. Τα αντισώματα είναι μια εντελώς θεωρητική έννοια που βασίζεται σε χημικές αντιδράσεις για τις οποίες υποτίθεται ότι τα αντισώματα υπάρχουν μέσα. Δεν μπορεί κανείς να χρησιμοποιήσει μια θεωρητική έννοια (αντισώματα) προκειμένου να αποδείξει την ύπαρξη μιας άλλης θεωρητικής έννοιας («ιοί»).
Ενώ η νέα τεχνική ΗΜ της Almeida απαιτεί άλματα στη λογική για να γίνει αποδεκτή, αυτό που είναι ακόμη πιο ανησυχητικό είναι οι προσπάθειες της ίδιας και του Tyrrell να πείσουν την επιστημονική κοινότητα ότι τα ίδια σωματίδια που αναγνωρίστηκαν ως γρίπη είναι στην πραγματικότητα ένας εντελώς νέος «ιός». Όχι μόνο είχαν αυτό που θεωρούσαν ότι μοιάζει με «ιό» γρίπης, αλλά είχαν και σωματίδια που έμοιαζαν ακριβώς τα ίδια. Στην πραγματικότητα, η ίδια η εργασία του Almeida απορρίφθηκε από την αξιολόγηση από ομότιμους, καθώς οι εικόνες χαρακτηρίστηκαν ως «κακές εικόνες σωματιδίων γρίπης»:
Η γυναίκα που ανακάλυψε τον πρώτο κοροναϊό
«Ωστόσο, μελέτες εθελοντών έδειξαν την ανάπτυξή του σε καλλιέργειες οργάνων και ο Dr Tyrrell αναρωτήθηκε αν θα μπορούσε να φανεί με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.
Έστειλαν δείγματα στην June Almeida, η οποία είδε τα σωματίδια του ιού στα δείγματα, τα οποία περιέγραψε ότι έμοιαζαν με τους ιούς της γρίπης, αλλά δεν ήταν ακριβώς τα ίδια.
Αναγνώρισε αυτό που έγινε γνωστό ως ο πρώτος ανθρώπινος κορονoϊός.
Ο κ. Winter λέει ότι η Dr Almeida είχε πράγματι δει τέτοια σωματίδια στο παρελθόν, όταν ερευνούσε την ηπατίτιδα ποντικών και τη λοιμώδη βρογχίτιδα των κοτόπουλων.
Ωστόσο, λέει ότι η εργασία της σε ένα περιοδικό με κριτές απορρίφθηκε «επειδή οι κριτές είπαν ότι οι εικόνες που παρήγαγε ήταν απλώς κακές εικόνες σωματιδίων του ιού της γρίπης».
Η νέα ανακάλυψη από το στέλεχος Β814 δημοσιεύτηκε στο British Medical Journal το 1965 και οι πρώτες φωτογραφίες αυτού που είχε δει δημοσιεύτηκαν στο Journal of General Virology δύο χρόνια αργότερα».
https://www.bbc.com/news/uk-scotland-52278716
Είναι προφανές ότι οι εικόνες της Almeida προέρχονταν από μια νέα μη δοκιμασμένη μέθοδο η οποία βασιζόταν σε θεωρητικά σωματίδια για να ορίσει άλλα θεωρητικά σωματίδια. Διάλεξε εκείνα που έμοιαζαν με τον «ιό» της γρίπης καθώς και εκείνα που είχε δει σε ασθένειες ποντικών και πτηνών. Θα διαπιστώσετε, αφού διαβάσετε την εργασία της, ότι η Almeida το έκανε αυτό χρησιμοποιώντας μη καθαρισμένα δείγματα, κάτι που, όπως ισχυρίστηκε, κατέστη δυνατό λόγω της δικής της προηγούμενης έρευνας. Με βάση τα παραπάνω, θα ήταν εύκολο να απορρίψει κανείς ευθέως τους ισχυρισμούς ότι οι εικόνες αυτές είναι σωματίδια που σχετίζονται με νέους «ιούς» χωρίς καν να διαβάσει την εργασία της, ωστόσο εδώ είναι η πλήρης εργασία για όσους θέλουν όλες τις πικάντικες λεπτομέρειες:
The Morphology of Three Previously Uncharacterized Human Respiratory Viruses that Grow in Organ Culture (Η μορφολογία τριών προηγουμένως αχαρακτήριστων ανθρώπινων αναπνευστικών ιών που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια οργάνων)
ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Περιγράφεται μια απλή μέθοδος για την εξέταση καλλιεργειών οργάνων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο για την παρουσία σωματιδίων ιών. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της παρουσίας τριών μέχρι σήμερα μη χαρακτηρισμένων ιών. Δύο από αυτούς έχουν σωματίδια που μοιάζουν με εκείνα της λοιμώδους βρογχίτιδας των κοτόπουλων και ο τρίτος μοιάζει μορφολογικά με την ομάδα ιών της παραϊνφλουέντζας (parainfluenza).
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Οι καλλιέργειες οργάνων του αναπνευστικού επιθηλίου αποτελούν ένα πρακτικό και ευαίσθητο µέσο για τον πολλαπλασιασµό των ανθρώπινων αναπνευστικών ιών. Ορισµένοι ιοί µπορούν προς το παρόν να καλλιεργηθούν µόνο µε αυτόν τον τρόπο (Tyrrell & Bynoe, 1965, 1966- Hoorn & Tyrrell, 1966). Δυστυχώς, αρκετοί τέτοιοι ιοί μπορούν να ανιχνευθούν μόνο με τον εμβολιασμό εθελοντών. Ως εκ τούτου, αποφασίστηκε να γίνει προσπάθεια ανίχνευσης αυτών των ιών και μορφολογικού χαρακτηρισμού τους με την τεχνική της αρνητικής χρώσης στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Αρχικά η αρνητική χρώση εφαρµόστηκε σε καθαρισµένα παρασκευάσµατα σωµατιδίων του ιού (Brenner&Horne, 1959), αλλά αργότερα αποδείχθηκε ότι ακατέργαστα παρασκευάσµατα ολόκληρων κυττάρων µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν για τη µελέτη των κυτταρικών ιών (Horne& Nagington, 1959- Almeida& Howatson, 1963- Parsons, 1963).
Στην παρούσα περίπτωση, εναιωρήματα που προέκυψαν από ήπια επεξεργασία των καλλιεργειών οργάνων σε γυάλινο ομογενοποιητή χρησιμοποιήθηκαν για μικροσκοπική εξέταση και παρατηρήθηκαν τρεις μη χαρακτηρισμένοι αναπνευστικοί ιοί. Δύο από αυτούς ανήκαν σε μορφολογικό τύπο που δεν είχε συνδεθεί προηγουμένως με ανθρώπινη ασθένεια.
ΜΕΘΟΔΟΙ
Καλλιέργεια οργάνων. Το ρινικό επιθήλιο και η τραχεία τεμαχίστηκαν από ανθρώπινα έμβρυα 14 έως 24 εβδομάδων κύησης και φυτεύτηκαν σε χαραγμένες περιοχές πλαστικών τρυβλίων Petri διαμέτρου 60 mm. AA grade (Esco Rubber Co.). Το ρινικό επιθήλιο εφοδιάστηκε με 2 ml. μέσου Eagle που περιείχε 0-2% (w/v) λευκωματίνη πλάσματος βοοειδών- η τραχεία έλαβε 1,25 ml. Τα τρυβλία επωάζονταν στους 33° σε σφραγισμένα υγραντικά πλαστικά κουτιά σε ατμόσφαιρα 5% (v/v) διοξειδίου του άνθρακα στον αέρα. Μετά από επώαση 2 ημερών, το μέσο άλλαξε και οι καλλιέργειες εμβολιάστηκαν με την πτώση 0,2 ml εναιωρήματος του ιού στον ιστό. Στη συνέχεια, οι καλλιέργειες επωάστηκαν για άλλες 4 ημέρες, οπότε αφαιρέθηκε το μέσο και, όπου ήταν δυνατόν, έγινε τιτλοδότηση του ιού σε καλλιέργειες ιστού με κυλινδρικό σωλήνα που επωάζονταν στους 33°.
Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τα θραύσματα ιστού επεξεργάστηκαν πολύ ελαφρά σε γυάλινο ομογενοποιητή τύπου TenBroeck με λίγες σταγόνες απεσταγμένου νερού. Το μεγαλύτερο μέρος του τεμαχίου ιστού παρέμεινε άθικτο και αποκολλήθηκαν κυρίως τα επιφανειακά, μολυσμένα από τον ιό κύτταρα. Μια σταγόνα από αυτό το εναιώρημα κυττάρων αναμίχθηκε με ίση ποσότητα φωσφοβολταμινικού οξέος 3 % (w/v) ρυθμισμένου σε pH 6,0 με υδροξείδιο του καλίου. Μια μικρή ποσότητα αυτού του μείγματος τοποθετήθηκε στη συνέχεια σε πλέγμα με επικάλυψη άνθρακα+φορμαβάρ, η περίσσεια του υγρού απομακρύνθηκε με διηθητικό χαρτί και το δείγμα εξετάστηκε αμέσως σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Philips 200. Εάν η διαδικασία αυτή δεν μπορούσε να πραγματοποιηθεί εντός λίγων ωρών από τη συλλογή των τεμαχίων ιστού, αυτά καταψύχονταν στους -70° μέχρι να είναι κατάλληλο.
Εξετάστηκαν διάφοροι γνωστοί ιοί για να διαπιστωθεί η πρακτικότητα της μεθόδου, η οποία χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια σε τρεις μη χαρακτηρισμένους ιούς που προκαλούν την ανώτερη αναπνευστική νόσο του ανθρώπου. Πρόκειται για: α) το στέλεχος 229 E των Hamre & Procknow (1966)- β) το στέλεχος B814 (Tyrrell & Bynoe, 1965)- γ) το στέλεχος LAKEY (Tyrrell & Bynoe, 1966).
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Τα ιϊκά σωματίδια ή ιϊκά συστατικά ανιχνεύθηκαν σχεδόν σε όλες τις καλλιέργειες που εμβολιάστηκαν με γνωστούς ιούς, και σε καμία περίπτωση σε μη εμβολιασμένο μάρτυρα. Ένας πρόσθετος έλεγχος πραγματοποιήθηκε με την εξέταση καλλιεργειών που είχαν εμβολιαστεί με ιούς του απλού έρπητα και του εμβολίου και στη συνέχεια δεν επωάστηκαν αλλά διατηρήθηκαν στους 4°. Σε αυτά τα παρασκευάσματα δεν παρατηρήθηκαν σωματίδια ιού.
Καθένας από τους τρεις μη χαρακτηρισμένους ανθρώπινους ιούς αποκάλυψε σωματίδια ιού ή ιικά συστατικά που σχετίζονταν με τα αρνητικά χρωματισμένα κυτταρικά θραύσματα. Το στέλεχος 229 E περιείχε σωματίδια (P1. 1, εικ. 1, 2) που έμοιαζαν πολύ με τα σωματίδια της λοιμώδους βρογχίτιδας των πτηνών (Berry et al. 1964). Τα σωµατίδια έχουν πλειοµορφική µορφή και, αν και ποικίλλουν κάπως σε µέγεθος, έχουν µέση διάµετρο περίπου 800 έως 1200 Α. Η επιφάνεια των σωµατιδίων καλύπτεται από ένα ευδιάκριτο στρώµα προεξοχών µήκους περίπου 200 Α. Οι προεξοχές αυτές φαίνεται να έχουν ένα στενό μίσχο ακριβώς εντός του ορίου ανάλυσης του μικροσκοπίου και μια «κεφαλή» με διάμετρο περίπου 100 Α.
Παρόµοια σωµατίδια βρέθηκαν σε καλλιέργειες οργάνων που µολύνθηκαν µε το δεύτερο µη χαρακτηρισµένο στέλεχος, το Β814, το οποίο προς το παρόν δεν µπορεί να καλλιεργηθεί σε καλλιέργειες ιστών (Tyrrell & Bynoe, 1965). Τα σωματίδια από το στέλεχος αυτό (P1. 1, εικ. 3, 4) ήταν δυσδιάκριτα τόσο από εκείνα του 229 Ε (P1. 1, εικ. 1, 2) όσο και από εκείνα της λοιμώδους βρογχίτιδας των πτηνών.
Το τρίτο άγνωστο στέλεχος, LAKEY, είχε ληφθεί από ρινικά πλυσίματα ενός ασθενούς με κρυολόγημα (Tyrrell & Bynoe, 1966). Είχε περάσει δύο φορές σε καλλιέργειες οργάνων και το μέσο από αυτές τις καλλιέργειες παρήγαγε κρυολόγημα σε εθελοντές. Σε µια περίπτωση είχε παρατηρηθεί πολύ φτωχή αιµοαπορρόφηση σε λίγα εξωτερικά κύτταρα µιας καλλιέργειας κυλινδρικού σωλήνα από νεφρό πιθήκου rhesus που είχε µολυνθεί 10 ηµέρες πριν µε µέσο καλλιέργειας. Αν και η παρατήρηση αυτή δεν μπορούσε να επαναληφθεί, ήταν ένα στοιχείο που υποδηλώνει ότι πρόκειται για κάποιο είδος μυξοϊού (myxovirus). Το παρασκεύασµα στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο έδειξε µεγάλη ποσότητα ελικοειδούς υλικού µε διάµετρο 180 Α, το οποίο δεν διέφερε από το εσωτερικό συστατικό ιών όπως η οµάδα της παραϊνφλουέντζας (ΠΙ. 2, εικ. 5, 6). Μέχρι να διαπιστωθεί οριστικά η προσρόφηση στα ερυθρά κύτταρα και η έκλουση από αυτά, δεν είναι δυνατόν να λεχθεί ότι πρόκειται για µυξοϊό, αλλά η µορφολογία που βρέθηκε αποδεικνύει ότι ο ιός ανήκει στην υποοµάδα των σύνθετων ιών που έχουν µορφολογία όπως αυτή του ιού της νόσου του Newcastle (Waterson & Almeida, 1966).
ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Η διαδικασία που χρησιμοποιήσαμε για την ταυτοποίηση των ιών που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια οργάνων είναι απλή και γρήγορη. Οποιαδήποτε προσπάθεια συµβατικής διαδικασίας καθαρισµού από τα τεµάχια ιστών θα ήταν δύσκολη και αναποτελεσµατική, δεδοµένου ότι η ποσότητα του διαθέσιµου υλικού είναι τόσο µικρή και το ποσοστό των µολυσµένων κυττάρων τόσο χαµηλό. Όταν η καλλιέργεια χειρίζεται με τον τρόπο που περιγράφεται, πιστεύουμε ότι τα κύτταρα που μπαίνουν σε εναιώρημα και χρησιμοποιούνται για την ηλεκτρονική μικροσκοπία είναι κυρίως αυτά που είναι μολυσμένα με ιό. Τα σωματίδια του ιού ταυτοποιήθηκαν ακόμη και όταν ο τίτλος στο υπερκείμενο ήταν χαμηλός.
Πιθανότατα το πιο ενδιαφέρον εύρημα από αυτά τα πειράματα ήταν ότι δύο ιοί του ανθρώπινου αναπνευστικού συστήματος, 229 Ε και Β814. είναι μορφολογικά πανομοιότυποι με τους ιούς της λοιμώδους βρογχίτιδας των πτηνών. Οι βιολογικές τους ιδιότητες, στο βαθμό που είναι γνωστές, είναι σύμφωνες με αυτό. Και οι δύο ανθρώπινοι ιοί είναι ευαίσθητοι στον αιθέρα όπως και ο 229 Ε της λοιμώδους βρογχίτιδας των πτηνών, έχουν παρόμοιο μέγεθος κατά τη διήθηση και πολλαπλασιάζονται παρουσία αναστολέα της σύνθεσης του DNA. Θα είναι ενδιαφέρον να συγκριθεί η ορολογική κατάσταση των μορφολογικά παρόμοιων ιών του ανθρώπου και του κοτόπουλου.
ΕΞΗΓΗΣΗ ΤΩΝ ΠΛΑΚΩΝ
ΠΙΝΑΚΑΣ 1
Εικ. 1 α, β. Αυτός ο τύπος σωματιδίων παρατηρήθηκε όταν οι καλλιέργειες οργάνων που είχαν μολυνθεί με το στέλεχος 229Ε εξετάστηκαν με την παρούσα τεχνική. Τα σωματίδια είναι πλειόμορφα, σε εύρος μεγέθους 800 έως 1200 Α και περιβάλλονται από ένα ευδιάκριτο περιθώριο μήκους 200 Α. Δεν διακρίνονται από τα σωματίδια της λοιμώδους βρογχίτιδας των πτηνών, του μοναδικού ιού που ήταν προηγουμένως γνωστό ότι έχει αυτή τη μορφολογία.
Εικ. 2. Ένα πρόσθετο µοναδικό σωµατίδιο του στελέχους 229E (για σύγκριση µε τις εικόνες 3 και 4).
Εικ. 3 και 4. Στέλεχος B814 του ανθρώπινου αναπνευστικού ιού, το οποίο επίσης αποκάλυψε σωματίδια που δεν διακρίνονται από τη λοιμώδη βρογχίτιδα των πτηνών. (Μεγέθυνση βλέπε ΠΙ. 2).
ΠΙΝΑΚΑΣ 2
Εικ. 5. Τμήμα του κυτταροπλάσματος ενός διαταραγμένου κυττάρου που περιέχει μεγάλη ποσότητα ελικοειδούς συστατικού παρόμοιο με αυτό που υπάρχει σε ιούς όπως ο ιός της παραϊνφλουέντζας (βλ. εικ. 6). Στην περίπτωση αυτή ο ιός ήταν ένας μη χαρακτηρισμένος ιός του ανθρώπινου αναπνευστικού συστήματος (LAKEY). Τα μολυσμένα δείγματα τραχείας και ρινικού επιθηλίου περιείχαν αμφότερα άφθονο ιικό υλικό.
Εικ. 6. Μήκος του εσωτερικού ελικοειδούς συστατικού από τον ιό της παραϊνφλουέντζας τύπου 3 που αναπτύχθηκε σε οργανική καλλιέργεια ρινικού επιθηλίου για σύγκριση με την εικ. 5. Η ράβδος αντιπροσωπεύει 1000 Α
doi 10.1099/0022-1317-1-2-175.
Περίληψη:
Η Almeida ανέπτυξε μια νέα τεχνική απεικόνισης για την ανίχνευση «ιών», γνωστή ως ανοσολογική ηλεκτρονική μικροσκοπία
Η τεχνική αυτή περιελάμβανε την ανίχνευση μορίων σε υπερδομικό επίπεδο με την επισήμανσή τους με ειδικά αντισώματα συνδεδεμένα με σωματίδια κολλοειδούς χρυσού. (Σημ.: πώς θα ήταν γνωστά τα «ειδικά» αντισώματα για έναν μη απομονωμένο, μη χαρακτηρισμένο «ιό» από μη καθαρισμένα δείγματα;).
Όταν μια δέσμη ηλεκτρονίων συναντά τα σωματίδια κολλοειδούς χρυσού σε ένα αντίσωμα συνδεδεμένο με το αντιγόνο του, παράγεται μια ηλεκτρονική σήμανση πυκνής μορφής
Η δέσμη ηλεκτρονίων σαρώνεται στη συνέχεια και η θέση της δέσμης, σε συνδυασμό με την ένταση του σήματος, χρησιμοποιείται για την παραγωγή μιας εικόνας, που αναφέρεται ως ηλεκτρονικό μικρογράφημα
Αυτό επιτρέπει την ανίχνευση και την οπτικοποίηση των σωματιδίων κολλοειδούς χρυσού και συνεπώς του μορίου-στόχου
Η ομάδα ερευνητών του Tyrrell είχε συλλέξει δείγματα ενός «ιού» που μοιάζει με γρίπη από έναν άρρωστο μαθητή
Ωστόσο, αντιμετώπιζαν προβλήματα στην καλλιέργεια αυτού του «ιού» με τη χρήση παραδοσιακών μεθόδων, γεγονός που τους οδήγησε στην υποψία ότι ίσως επρόκειτο για έναν εντελώς νέο τύπο «ιού»
Η Almeida μπόρεσε να παράγει «καθαρές» εικόνες του «ιού» και σημείωσε ότι έμοιαζε με δύο παρόμοιους «ιούς» που είχε απεικονίσει προηγουμένως κατά τη μελέτη της βρογχίτιδας σε κοτόπουλα και της ηπατίτιδας ποντικού
Αυτές είχαν προηγουμένως απορριφθεί και η εργασία της, η οποία είχε σταλεί σε περιοδικό με κριτές, απορρίφθηκε «επειδή οι κριτές είπαν ότι οι εικόνες που παρήγαγε ήταν απλώς κακές εικόνες σωματιδίων “ιού” γρίπης».
Ωστόσο, οι εικόνες του «ιού» στα δείγματα από τον μαθητή σε συνδυασμό με τις εικόνες από την προηγούμενη εργασία της Almeida έπεισαν τους Almeida και Tyrrell ότι επρόκειτο στην πραγματικότητα για μια νέα οικογένεια «ιών»
Περιγράφηκε μια απλή μέθοδος για την εξέταση καλλιεργειών οργάνων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο για την παρουσία σωματιδίων «ιού» (πώς θα ήξερε ποια ήταν σωματίδια «ιού» και ποια όχι;)
Δύο από τις καλλιέργειες είχαν σωματίδια που έμοιαζαν με εκείνα της λοιμώδους βρογχίτιδας των κοτόπουλων και η τρίτη έμοιαζε μορφολογικά με την ομάδα «ιών» της παραϊνφλουέντζας
Ο Almeida ισχυρίστηκε ότι αρκετοί «ιοί» μπορούσαν να ανιχνευθούν μόνο με τον εμβολιασμό εθελοντών (Σημ.:τι ακριβώς έκαναν ενέσεις αφού δεν γνώριζαν αν υπήρχε ή όχι ένας «ιός;)
Αποφασίστηκε να προσπαθήσουν να ανιχνεύσουν αυτούς τους «ιούς» και να τους χαρακτηρίσουν μορφολογικά με την τεχνική της αρνητικής χρώσης στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο
Αρχικά, η αρνητική χρώση εφαρμόστηκε σε καθαρισμένα παρασκευάσματα σωματιδίων του «ιού», αλλά η Almeida δήλωσε ότι αργότερα αποδείχθηκε ότι ακατέργαστα παρασκευάσματα ολόκληρων κυττάρων μπορούσαν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη των κυτταρικών «ιών» με βάση τα αποτελέσματα της δικής της εργασίας
Γρήγορη παράκαμψη σχετικά με την εργασία της Almeida για τα ακατέργαστα παρασκευάσματα (1963):
ΜΙΑ ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΧΡΩΣΗΣ ΓΙΑ ΙΟΥΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΑ
«Συνοπτικά, η τεχνική που περιγράφεται εδώ προσφέρει τρία κύρια πλεονεκτήματα στην εξέταση των μολυσμένων από ιούς κυττάρων με αρνητική χρώση.
Πρώτον, είναι μια ευαίσθητη και γρήγορη μέθοδος για τη διαπίστωση της παρουσίας ή απουσίας του ιού σε οποιοδήποτε παρασκεύασμα.
Δεύτερον, δεδομένου ότι το υλικό δέχεται τον ελάχιστο δυνατό χειρισμό, οι ιοί διατηρούν δομικές λεπτομέρειες που μπορεί να χαθούν σε χρονοβόρες διαδικασίες καθαρισμού.
Τρίτον, ένας ιός μπορεί να εξεταστεί σε σχέση με άλλα σωματίδια γύρω του και με τα συστατικά του κυττάρου στο οποίο περιέχεται».
doi: 10.1083/jcb.16.3.616.
Σύμφωνα με την Almeida, οι διαδικασίες καθαρισμού μπορεί να καταστρέψουν δομικές λεπτομέρειες, γι' αυτό ήθελε να έχει ελάχιστους χειρισμούς προκειμένου να εξετάσει αυτά τα άγνωστα, μη χαρακτηρισμένα σωματίδια σε σχέση με τα άλλα σωματίδια γύρω τους. Αυτό εγείρει το ερώτημα, αν δεν είχε δει ποτέ πριν αυτούς τους «ιούς» ούτε τους είχε χαρακτηρίσει, πώς θα ήξερε ποια είναι τα σωματίδια του «ιού» που αναζητά σε σχέση με εκείνα που βρίσκονται γύρω τους; Προφανώς, αυτή η παραδοχή ότι εξέτασε μη καθαρισμένο υλικό για να βρει τα σωματίδια που ισχυρίζεται ότι είναι «κορονοϊοί» απαξιώνει αμέσως τις εικόνες της.
Τέλος της Παράκαμψης.
Επεξεργασία καλλιέργειας οργάνων:
Το ρινικό επιθήλιο και η τραχεία τεμαχίστηκαν από ανθρώπινα έμβρυα 14 έως 24 εβδομάδων κύησης και φυτεύτηκαν σε χαραγμένες περιοχές πλαστικών τρυβλίων Petri διαμέτρου 60 mm. AA grade (Esco Rubber Co.)
Το ρινικό επιθήλιο εφοδιάστηκε με 2 ml μέσου Eagle που περιείχε 0-2% (w/v) λευκωματίνη πλάσματος βοοειδών- η τραχεία έλαβε 1,25 ml
Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 33° σε σφραγισμένα υγραντικά πλαστικά κουτιά σε ατμόσφαιρα 5% (v/v) διοξειδίου του άνθρακα στον αέρα.
Μετά από επώαση 2 ημερών, το μέσο άλλαξε και οι καλλιέργειες εμβολιάστηκαν με την πτώση 0,2 ml εναιωρήματος «ιού» στον ιστό
Στη συνέχεια, οι καλλιέργειες επωάστηκαν για άλλες 4 ημέρες, οπότε αφαιρέθηκε το μέσο και, όπου ήταν δυνατόν, τιτλοδοτήθηκαν για «ιό» σε κυλινδρικές καλλιέργειες ιστού επωασμένες στους 33°.
Για την ΗΜ απεικόνιση, μια σταγόνα κυτταρικού εναιωρήματος αναμίχθηκε με ίση ποσότητα φωσφοβολταμινικού οξέος 3 % (w/v) προσαρμοσμένου σε pH 6,0 με υδροξείδιο του καλίου
Εξετάστηκαν διάφοροι γνωστοί «ιοί» για να διαπιστωθεί η εφαρμοσιμότητα της μεθόδου, η οποία χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια σε τρεις μη χαρακτηρισμένους «ιούς» που προκαλούν ασθένειες του ανώτερου αναπνευστικού στον άνθρωπο.
Σημ.: Με άλλα λόγια, χρησιμοποίησε τη μέθοδο αυτή για να βρει σωματίδια που θεωρούνταν ήδη «ιοί» προκειμένου να δηλώσει ότι ήταν αποτελεσματική για την εύρεση άγνωστων «ιών».
Τα σωματίδια «ιών» ή τα συστατικά «ιών» ανιχνεύθηκαν σχεδόν σε όλες τις καλλιέργειες που εμβολιάστηκαν με γνωστούς «ιούς»
Ένας πρόσθετος «έλεγχος» πραγµατοποιήθηκε µε την εξέταση καλλιεργειών που είχαν εµβολιαστεί µε «ιούς» απλού έρπητα και vaccinia και στη συνέχεια δεν επωάστηκαν, αλλά διατηρήθηκαν στους 4°, αλλά δεν παρατηρήθηκαν σωµατίδια «ιού» σε αυτά τα παρασκευάσµατα.
Καθένας από τους τρεις μη χαρακτηρισμένους ανθρώπινους «ιούς» αποκάλυψε σωματίδια «ιού» ή συστατικά «ιού» που συνδέονται με τα αρνητικά χρωματισμένα κυτταρικά θραύσματα.
Σημ.: Θα πρέπει να είναι σαφές ότι ένας «ιός» θεωρήθηκε ότι βρισκόταν μέσα στα μη καθαρισμένα δείγματα, καθώς δεν είχαν απομονωθεί ούτε χαρακτηριστεί σωματίδια
Το στέλεχος 229 Ε του Hamre περιείχε σωματίδια που έμοιαζαν πολύ με τα σωματίδια της λοιμώδους βρογχίτιδας των πτηνών
Το στέλεχος B814 του Tyrrell παρουσίασε παρόμοια σωματίδια σε καλλιέργειες οργάνων.
Το άλλο άγνωστο στέλεχος του Tyrrell, το LAKEY, είχε ληφθεί από τις ρινικές πλύσεις ενός ασθενούς με κρυολόγημα και είχε περάσει δύο φορές σε καλλιέργειες οργάνων και ήταν δυσδιάκριτο από το εσωτερικό συστατικό «ιών» όπως η ομάδα της παραϊνφλουέντζας
Ο Almeida ισχυρίστηκε ότι οποιαδήποτε προσπάθεια συμβατικής διαδικασίας καθαρισμού από τα θραύσματα ιστών θα ήταν δύσκολη και αναποτελεσματική, δεδομένου ότι η ποσότητα του διαθέσιμου υλικού είναι τόσο μικρή και το ποσοστό των μολυσμένων κυττάρων είναι τόσο χαμηλό
Όταν η καλλιέργεια χειριζόταν με τον τρόπο που περιέγραψε, πίστευε ότι τα κύτταρα που πήγαιναν σε εναιώρημα και χρησιμοποιούνταν για την ηλεκτρονική μικροσκοπία ήταν κυρίως εκείνα που είχαν μολυνθεί με «ιό»
Η Almeida κατέληξε στο συμπέρασμα ότι το πιο ενδιαφέρον εύρημα από τα πειράματα αυτά ήταν ότι δύο ανθρώπινοι αναπνευστικοί «ιοί», ο 229 Ε και ο Β814, ήταν μορφολογικά πανομοιότυποι με τη λοιμώδη βρογχίτιδα των πτηνών και ότι οι βιολογικές τους ιδιότητες, στο βαθμό που ήταν γνωστές, συμφωνούσαν με αυτό
Τουλάχιστον, ήταν εξαιρετικά ευγενικό εκ μέρους της Almeida να παραδεχτεί ότι δεν καθάρισε ούτε απομόνωσε τα σωματίδια που θεωρήθηκαν «ιοί» πριν από τη λήψη των φωτογραφιών τους, ώστε να μπορούμε να απορρίψουμε αμέσως τους ισχυρισμούς ότι τα σωματίδια αυτά είναι πράγματι «ιοί». Προφανώς, τα στάδια καθαρισμού και απομόνωσης θα έπρεπε να είχαν πραγματοποιηθεί πρώτα από τους Tyrrell και Hamre, αλλά δυστυχώς δεν έκαναν κάτι τέτοιο, οπότε το μόνο που έμεινε στην Almeida ήταν η μη καθαρισμένη γλίτσα οργάνων και ιστοκαλλιεργειών για να ψάξει μέχρι να βρει και να ξεχωρίσει τα σωματίδια που έμοιαζαν με τους "ιούς" που ήθελε να δει. Το γεγονός ότι αυτά τα σωματίδια όχι μόνο έμοιαζαν με γρίπη αλλά απορρίφθηκαν από την αξιολόγηση από ομοτίμους επειδή περιγράφηκαν ως "κακές εικόνες της γρίπης" θα πρέπει να είναι αρκετό για να συνειδητοποιήσουμε ότι το μόνο που έκανε η Almeida ήταν να αναζητήσει σωματίδια που έμοιαζαν με "ιούς" και τα οποία ταίριαζαν σε ένα προκαθορισμένο καλούπι για το πώς πρέπει να μοιάζει ένας "ιός". Το γεγονός ότι αυτά τα σωματίδια έτυχε επίσης ως δια μαγείας να ταιριάζουν με εκείνα που είχε δει προηγουμένως σε ποντίκια και κοτόπουλα αποτελεί περαιτέρω απόδειξη ότι η Almeida βασίστηκε στις δικές της ερμηνευτικές προκαταλήψεις για να χαρακτηρίσει τα μη καθαρισμένα σωματίδια ως την αναπαράσταση αυτών των νέων "ιών". Η Almeida δεν ανακάλυψε κανέναν νέο "ιό" στη μη καθαρισμένη γλίτσα που της έδωσαν οι Tyrrell και Hamre. Το μόνο που έκανε ήταν να απεικονίσει και να μεταπωλήσει τα ίδια σωματίδια που είχαν προηγουμένως αναγνωριστεί ως γρίπη και πάλι στο κοινό ως έναν… τρομακτικό νέο μπαμπούλα που τώρα συνδέεται με το κοινό κρυολόγημα.
Αν σας άρεσε αυτό το άρθρο, μοιραστείτε το με την οικογένεια, τους φίλους και τους συναδέλφους σας, εγγραφείτε για να λαμβάνετε περισσότερο περιεχόμενο και αν θέλετε να στηρίξετε το συνεχές έργο μου, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε τον παρακάτω σύνδεσμο.
Παρακαλώ βοηθήστε να στηρίξετε το έργο μου. 🙏
---Δικτυογραφία:
June Almeida And The First “Coronavirus” EM Images (1967) – ViroLIEgy
https://viroliegy.com/2021/12/07/june-almeida-and-the-first-coronavirus-em-images-1967/