ΦΑΚΕΛΛΟΣ "ΙΟΛΟΓΙΑ": Η Εργασία του Drosten: "PCR Τεστ για τον "SARS-COV-2"
Μετάφραση: Απολλόδωρος
18 Σεπτεμβρίου 2021 | Mike Stone, ViroLIEgy | Διαβάστε το εδώ
"In Silico: σε ή σε υπολογιστή : γίνεται ή παράγεται με τη χρήση λογισμικού ή προσομοίωσης υπολογιστή "
Δεν θα μπω σε πολλές λεπτομέρειες σχετικά με το τεστ PCR του Drosten, καθώς καλύφθηκε περίφημα από ανθρώπους πολύ πιο κατάλληλους από εμένα (σύνδεσμος παρακάτω), αλλά θα ήταν παράλειψη αν δεν το ανέφερα καθόλου. Ο Drosten συνέβαλε καθοριστικά στην απάτη του "SARS-COV-1" και, φυσικά, η εμπειρία του όσον αφορά τη χειραγώγηση των μαζών με ψευδοεπιστήμη χρησιμοποιήθηκε με τον "SARS-COV-2". Έχει τόση μεγάλη εμπειρία με αυτούς τους "ιούς", που ήταν σε θέση να δημιουργήσει ένα "διαγνωστικό" τεστ PCR in silico (σε ηλεκτρονικό υπολογιστή) ελλείψει απομονωμένων στελεχών του "SARS-COV-2" βασιζόμενος κυρίως σε αναφορές στα μέσα κοινωνικής δικτύωσης. Αυτό απαιτεί ταλέντο, φίλοι μου. Τα κυριότερα σημεία παρακάτω:
Ανίχνευση του νέου κοροναϊού του 2019 (2019-nCoV) με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο
Ιστορικό
"Η συνεχιζόμενη επιδημία του πρόσφατα εμφανιζόμενου νέου κοροναϊού (2019-nCoV) αποτελεί πρόκληση για τα εργαστήρια δημόσιας υγείας, καθώς δεν υπάρχουν απομονωμένα δείγματα του ιού , ενώ αυξάνονται οι ενδείξεις ότι η επιδημία είναι πιο διαδεδομένη από ό,τι αρχικά είχε θεωρηθεί και ότι η διεθνής εξάπλωση μέσω ταξιδιωτών έχει ήδη συμβεί.
Στόχος
Στόχος μας ήταν να σχεδιάσουμε και να αναπτύξουμε ισχυρή διαγνωστική μεθοδολογία για χρήση σε εργαστήρια δημόσιας υγείας χωρίς να υπάρχει διαθέσιμο υλικό ιού.
Μέθοδοι
Εδώ παρουσιάζουμε μια επικυρωμένη διαγνωστική ροή εργασίας για τον 2019-nCoV, ο σχεδιασμός της οποίας βασίζεται στη στενή γενετική συγγένεια του 2019-nCoV με τον κορονοϊό SARS, κάνοντας χρήση της τεχνολογίας συνθετικών νουκλεϊκών οξέων.
Αποτελέσματα
Η ροή εργασίας ανιχνεύει αξιόπιστα τον 2019-nCoV και διακρίνει περαιτέρω τον 2019-nCoV από τον SARS-CoV. Μέσω του συντονισμού μεταξύ ακαδημαϊκών και δημόσιων εργαστηρίων, επιβεβαιώσαμε την αποκλειστικότητα της ανάλυσης με βάση 297 πρωτότυπα κλινικά δείγματα που περιείχαν ένα πλήρες φάσμα ανθρώπινων αναπνευστικών ιών. Το υλικό ελέγχου διατίθεται μέσω του European Virus Archive - Global (EVAg), ενός έργου υποδομής της Ευρωπαϊκής Ένωσης».
«Ένας νέος κορονοϊός που επί του παρόντος ονομάζεται 2019-nCoV ανακοινώθηκε επίσημα ως ο αιτιολογικός παράγοντας από τις κινεζικές αρχές στις 7 Ιανουαρίου. Μια αλληλουχία του ιικού γονιδιώματος κυκλοφόρησε για άμεση υποστήριξη της δημόσιας υγείας μέσω του κοινοτικού διαδικτυακού πόρου virological.org στις 10 Ιανουαρίου (Wuhan-Hu-1, αριθμός πρόσβασης GenBank MN908947 [2]), ενώ ακολούθησαν τέσσερα άλλα γονιδιώματα που κατατέθηκαν στις 12 Ιανουαρίου στη βάση δεδομένων ιικών αλληλουχιών που επιμελείται η Παγκόσμια Πρωτοβουλία για την Κοινή Χρήση όλων των Δεδομένων Γρίπης (GISAID). Οι αλληλουχίες των γονιδιωμάτων υποδηλώνουν την παρουσία ενός ιού που σχετίζεται στενά με τα μέλη ενός ιϊκού είδους που ονομάζεται CoV που σχετίζεται με το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS), ένα είδος που ορίζεται από τον παράγοντα της επιδημίας SARS στον άνθρωπο το 2002/03 [3,4]. Το είδος περιλαμβάνει επίσης μεγάλο αριθμό ιών που ανιχνεύονται κυρίως σε ρινοφόρες νυχτερίδες στην Ασία και την Ευρώπη».
«Μεταξύ των πρωταρχικών προτεραιοτήτων για τη διευκόλυνση των παρεμβάσεων στη δημόσια υγεία είναι η αξιόπιστη εργαστηριακή διάγνωση. Στην οξεία αναπνευστική λοίμωξη, η RT-PCR χρησιμοποιείται συνήθως για την ανίχνευση των αιτιολογικών ιών από τις αναπνευστικές εκκρίσεις. Στο παρελθόν έχουμε αποδείξει τη δυνατότητα εισαγωγής αξιόπιστης τεχνολογίας ανίχνευσης με βάση την RT-PCR πραγματικού χρόνου σε εργαστήρια δημόσιας υγείας κατά τη διάρκεια διεθνών καταστάσεων έκτακτης ανάγκης στον τομέα της υγείας με συντονισμό μεταξύ δημόσιων και ακαδημαϊκών εργαστηρίων [6–12]. Σε όλες αυτές τις καταστάσεις, απομονωμένα ιού ήταν διαθέσιμα ως το πρωταρχικό υπόστρωμα για την καθιέρωση και τον έλεγχο των δοκιμών και της απόδοσης των δοκιμών.
Στην παρούσα περίπτωση του 2019-nCoV, απομονωμένα ιού ή δείγματα από μολυσμένους ασθενείς δεν έχουν γίνει μέχρι στιγμής διαθέσιμα στη διεθνή κοινότητα δημόσιας υγείας. Αναφέρουμε εδώ τη δημιουργία και την επικύρωση μιας διαγνωστικής ροής εργασίας για τον έλεγχο και την ειδική επιβεβαίωση του 2019-nCoV, η οποία σχεδιάστηκε ελλείψει διαθέσιμων απομονωμένων ιϊκών στελεχών ή αρχικών δειγμάτων ασθενών. Ο σχεδιασμός και η επικύρωση κατέστησαν δυνατή λόγω της στενής γενετικής συγγένειας με τον SARS-CoV του 2003 και υποβοηθήθηκαν από τη χρήση της τεχνολογίας συνθετικών νουκλεϊκών οξέων.
Μέθοδοι
Κλινικά δείγματα και υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας κοροναϊών για την αρχική αξιολόγηση της δοκιμασίας
Υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας που περιείχαν τυποποιημένους κορονοϊούς και άλλους αναπνευστικούς ιούς παραχωρήθηκαν από τα ερευνητικά εργαστήρια του Charité και του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ. Τα αναπνευστικά δείγματα ελήφθησαν κατά τη διάρκεια του 2019 από ασθενείς που νοσηλεύονταν στο ιατρικό κέντρο Charité και εξετάστηκαν με το πάνελ παθογόνων αναπνευστικών παθογόνων NxTAG (Luminex, S´Hertogenbosch, Κάτω Χώρες) ή σε περιπτώσεις MERS-CoV με τη δοκιμασία MERS-CoV upE, όπως έχει δημοσιευθεί προηγουμένως [10]. Πρόσθετα δείγματα επιλέχθηκαν από βιοτράπεζες στο Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM), Bilthoven, στο Erasmus University Medical Center, Rotterdam, στο Public Health England (PHE), London, και στο University of Hong Kong. Τα δείγματα από όλες τις συλλογές περιλάμβαναν πτύελα καθώς και επιχρίσματα μύτης και λαιμού με ή χωρίς μέσο μεταφοράς ιού.
Εξετάστηκαν δείγματα κοπράνων που περιείχαν δείγματα CoV που προέρχονται από νυχτερίδες και σχετίζονται με SARS (ταυτοποιήθηκαν με βάση τους αριθμούς καταχώρησης GenBank): : KC633203, Betacoronavirus BtCoV/Rhi_eur/BB98–98/BGR/2008; KC633204, Betacoronavirus BtCoV/Rhi_eur/BB98–92/BGR/2008; KC633201, Betacoronavirus BtCoV/Rhi_bla/BB98–22/BGR/2008; GU190221 Betacoronavirus Bat coronavirus BR98–19/BGR/2008; GU190222 Betacoronavirus Bat coronavirus BM98–01/BGR/2008; GU190223, Betacoronavirus Bat coronavirus BM98–13/BGR/2008.
Όλο το συνθετικό RNA που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη ποσοτικοποιήθηκε φωτομετρικά».
PCR αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο
«Μια αντίδραση 25 μL περιείχε 5 μL RNA, 12,5 μL ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης 2 × που παρέχεται με το σύστημα Superscript III one step RT-PCR με Platinum Taq πολυμεράση (Invitrogen, Darmstadt, Γερμανία- περιέχει 0. 4 mM από κάθε τριφωσφορικό δεοξυριβόνιο (dNTP) και 3,2 mM θειικό μαγνήσιο), 1 μL μίγματος αντίστροφης μεταγραφάσης/Taq από το κιτ, 0,4 μL διαλύματος θειικού μαγνησίου 50 mM (Invitrogen) και 1 μg μη ακετυλιωμένης αλβουμίνης ορού βοοειδών (Roche). Οι αλληλουχίες των εκκινητών και των ανιχνευτών, καθώς και οι βελτιστοποιημένες συγκεντρώσεις παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Όλα τα ολιγονουκλεοτίδια συντέθηκαν και παρασχέθηκαν από την Tib-Molbiol (Βερολίνο, Γερμανία). Η θερμική ανακύκλωση πραγματοποιήθηκε στους 55 °C για 10 λεπτά για την αντίστροφη μεταγραφή, ακολουθούμενη από 95 °C για 3 λεπτά και στη συνέχεια 45 κύκλους 95 °C για 15 δευτερόλεπτα, 58 °C για 30 δευτερόλεπτα».
«Η προβλεπόμενη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα όλων των δοκιμασιών με το ιικό RNA του SARS-CoV μας επιτρέπει να χρησιμοποιούμε τις δοκιμασίες χωρίς να χρειάζεται να βασιζόμαστε σε εξωτερικές πηγές ειδικού RNA 2019-nCoV.»
Αποτελέσματα
«Πριν από τη δημοσιοποίηση των αλληλουχιών του ιού από κρούσματα του 2019-nCoV, βασιστήκαμε σε αναφορές στα μέσα κοινωνικής δικτύωσης που ανακοίνωναν την ανίχνευση ενός ιού που μοιάζει με τον ιό SARS. Υποθέσαμε έτσι ότι στην επιδημία εμπλέκεται ένας CoV που σχετίζεται με τον SARS. Κατεβάσαμε όλες τις πλήρεις και μερικές (εάν > 400 nt) αλληλουχίες ιού που σχετίζονται με τον SARS που ήταν διαθέσιμες στη GenBank έως την 1η Ιανουαρίου 2020. Ο κατάλογος (n = 729 καταχωρίσεις) ελέγχθηκε χειροκίνητα και αφαιρέθηκαν οι τεχνητές αλληλουχίες (εργαστηριακές, συνθετικές κ.λπ.), καθώς και τα αντίγραφα αλληλουχιών, με αποτέλεσμα να προκύψει ένας τελικός κατάλογος 375 αλληλουχιών. Οι αλληλουχίες αυτές ευθυγραμμίστηκαν και η ευθυγράμμιση χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό της ανάλυσης (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Μετά τη δημοσίευση της πρώτης αλληλουχίας του 2019-nCoV στο virological.org, επιλέχθηκαν τρεις δοκιμασίες με βάση το πόσο καλά ταίριαζαν με το γονιδίωμα του 2019-nCoV (Εικόνα 1). Η ευθυγράμμιση συμπληρώθηκε από πρόσθετες αλληλουχίες που κυκλοφόρησαν ανεξάρτητα στο GISAID (https://www.gisaid.org), επιβεβαιώνοντας την καλή αντιστοίχιση των επιλεγμένων εκκινητών με όλες τις αλληλουχίες. Η ευθυγράμμιση των περιοχών πρόσδεσης των εκκινητών με τον 2019-nCoV, τον SARS-CoV καθώς και επιλεγμένους CoV που σχετίζονται με τον SARS των νυχτερίδων παρουσιάζεται στην Εικόνα 2.
Ευαισθησία της ανάλυσης με βάση τους ιούς του κορονοϊού SARS
Για να λάβουμε μια προκαταρκτική αξιολόγηση της αναλυτικής ευαισθησίας, χρησιμοποιήσαμε καθαρισμένο υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας που περιείχε ιούς του στελέχους SARS-CoV Frankfurt-1 που αναπτύχθηκαν σε κύτταρα Vero. Το υπερκείμενο διηθήθηκε με υπερδιήθηση και έτσι συμπυκνώθηκε από περίπου 20πλάσιο όγκο υπερκείμενου υγρού κυτταροκαλλιέργειας. Το στάδιο της συγκέντρωσης μειώνει ταυτόχρονα τη σχετική συγκέντρωση των νουκλεϊκών οξέων υποβάθρου, όπως το μη συσκευασμένο σε ιούς RNA. Το παρασκεύασμα ιόντων ποσοτικοποιήθηκε με RT-PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας ένα ειδικό πρότυπο ποσοτικοποίησης in vitro μεταγραφέντος RNA, όπως περιγράφεται στους Drosten et al. [8]».
Διάκριση του νέου κορονοϊού του 2019 από τον κορονοϊό SARS με δοκιμασία RdRp
«Ακολουθώντας το σκεπτικό ότι το RNA του SARS-CoV μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θετικός έλεγχος για ολόκληρη την εργαστηριακή διαδικασία, εξαλείφοντας έτσι την ανάγκη χειρισμού του RNA του 2019-nCoV, διαμορφώσαμε τη δοκιμασία RdRp έτσι ώστε να περιέχει δύο ανιχνευτές: έναν ανιχνευτή ευρέος φάσματος που αντιδρά με τον SARS-CoV και τον 2019-nCoV και έναν πρόσθετο ανιχνευτή που αντιδρά μόνο με τον 2019-nCoV. Με πειράματα περιοριστικής αραίωσης, επιβεβαιώσαμε ότι και οι δύο ανιχνευτές, είτε χρησιμοποιούνται μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό, παρέχουν την ίδια LOD για κάθε ιό-στόχο. Ο ειδικός ανιχνευτής RdRP_SARSr-P2 ανίχνευσε μόνο το μεταγράφημα RNA του 2019-nCoV αλλά όχι το RNA του SARS-CoV».
«Για να δείξουμε ότι οι δοκιμασίες μπορούν να ανιχνεύσουν άλλους ιούς που σχετίζονται με SARS και σχετίζονται με νυχτερίδες, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία γονιδίου Ε για να εξετάσουμε έξι δείγματα κοπράνων νυχτερίδας που είναι διαθέσιμα από τους Drexler et al.[13]και Muth et al. [14]. Αυτά τα θετικά για τον ιό δείγματα προέρχονταν από ευρωπαϊκές ρινοφόρες νυχτερίδες. Η ανίχνευση αυτών των φυλογενετικών ακραίων σημείων εντός της κλάσης CoV που σχετίζεται με τον SARS υποδηλώνει ότι είναι πιθανό να ανιχνευθούν όλοι οι ασιατικοί ιοί. Αυτό θα εξασφάλιζε, θεωρητικά, ευρεία ευαισθησία ακόμη και στην περίπτωση πολλαπλών ανεξάρτητων αποκτήσεων παραλλαγών των ιών από μια δεξαμενή ζώων».
Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλους κορονοϊούς
«Τα υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας που περιείχαν όλους τους ενδημικούς ανθρώπινους κοροναϊούς (HCoV)-229E, -NL63, -OC43 και -HKU1 καθώς και τον MERS-CoV εξετάστηκαν εις διπλούν και στις τρεις δοκιμασίες (Πίνακας 2). Για τον μη καλλιεργήσιμο HCoV-HKU1 χρησιμοποιήθηκε υπερκείμενο από καλλιέργεια ανθρώπινων αεραγωγών. Η συγκέντρωση του ιϊκού RNA σε όλα τα δείγματα προσδιορίστηκε με ειδικές RT-PCR πραγματικού χρόνου και με πρότυπα in vitro μεταγραφέντος RNA που σχεδιάστηκαν για τον απόλυτο ποσοτικό προσδιορισμό του ιικού φορτίου. Εξετάστηκαν επιπλέον αδιαλύτως (αλλά όχι ποσοτικά) υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 2. Αυτά αναμίχθηκαν επιπλέον σε αρνητικά δείγματα ανθρώπινων πτυέλων. Κανένας από τους εξετασθέντες ιούς ή παρασκευάσματα ιών δεν παρουσίασε αντιδραστικότητα με καμία δοκιμασία.»
Συζήτηση
«Η παρούσα έκθεση περιγράφει την καθιέρωση μιας διαγνωστικής ροής εργασίας για την ανίχνευση ενός αναδυόμενου ιού ελλείψει φυσικών πηγών ιικού γονιδιωματικού νουκλεϊκού οξέος. Ο αποτελεσματικός σχεδιασμός της δοκιμασίας κατέστη δυνατός χάρη στην προθυμία των επιστημόνων από την Κίνα να μοιραστούν πληροφορίες για το γονιδίωμα πριν από την επίσημη δημοσίευση, καθώς και στη διαθεσιμότητα ευρείας γνώσης της αλληλουχίας από περίπου 15 χρόνια διερεύνησης των ιών που σχετίζονται με τον SARS σε δεξαμενές ζώων.»
«Τα δεδομένα τεχνικής εξειδίκευσης με βάση υλικά κυτταροκαλλιέργειας και συνθετικές κατασκευές, καθώς και τα αποτελέσματα από τη δοκιμή αποκλειστικότητας σε 75 κλινικά δείγματα, συμπεριλήφθηκαν στην πρώτη έκδοση του διαγνωστικού πρωτοκόλλου που δόθηκε στον ΠΟΥ στις 13 Ιανουαρίου 2020. «
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/#!po=0.746269
Συνοψίζοντας:
Δεν υπήρχαν διαθέσιμα «απομονωμένα στελέχη του ιού» κατά τη στιγμή που ο Drosten δημιούργησε τη δοκιμή PCR του
Στόχος της μελέτης του ήταν να αναπτύξει ένα τεστ χωρίς να χρειάζεται υλικό «ιού»
Η ροή εργασίας βασίστηκε στη «στενή γενετική συγγένεια» μεταξύ του «SARS-COV-1» και του «SARS-COV-2» (μόνο 79% που στην πραγματικότητα δεν είναι καθόλου στενή) με τη χρήση της τεχνολογίας ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ νουκλεϊκών οξέων.
Βασίστηκαν στην αποκλειστικότητα της ανάλυσης με βάση 297 κλινικά δείγματα που περιείχαν μια σειρά από αναπνευστικούς «ιούς», αλλά κανένα με «SARS-COV-2».
Η αλληλουχία του γονιδιώματος που παρασχέθηκε από τους Κινέζους ΥΠΕΔΕΙΞΕ έναν «ιό» που σχετίζεται με τον «SARS-COV-1».
Στις προηγούµενες εξελίξεις των δοκιµών τους, « αποµονωµένα ιού» ήταν διαθέσιµα ως το πρωταρχικό υπόστρωµα για την καθιέρωση και τον έλεγχο των δοκιµών και των επιδόσεων των δοκιµών.
Δεδομένου ότι αυτή τη φορά δεν υπήρχαν διαθέσιμα « απομονωμένα ιού», αποφάσισαν ότι η υποτιθέμενη σχέση με τον «SARS-COV-1» ήταν αρκετή για να αναπτύξουν μια αξιόπιστη δοκιμή με τη χρήση της τεχνολογίας συνθετικών νουκλεϊκών οξέων.
Το υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας για διαφορετικούς «ιούς» παρασχέθηκε από το Charite και διάφορες άλλες πηγές
Τα δείγματα προέρχονταν από πτύελα καθώς και από επιχρίσματα μύτης και λαιμού με ή χωρίς μέσα μεταφοράς ιών
Χρησιμοποίησαν επίσης δείγματα κοπράνων που υποτίθεται ότι περιείχαν «κορονοϊούς» που σχετίζονται με νυχτερίδες.
Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκε συνθετικό RNA
Κατά τη διάρκεια της RT-PCR, χρησιμοποιήθηκαν διάφορες χημικές ουσίες μαζί με μη ακετυλιωμένη αλβουμίνη ορού βοοειδών
Όλα τα ολιγονουκλεοτίδια συντέθηκαν
Οι δοκιμές RT-PCR διεξήχθησαν σε 45 κύκλους (θυμηθείτε, σύμφωνα με τον Fauci, οτιδήποτε πάνω από 35 είναι απλώς νεκρά νουκλεοτίδια)
Η επιδιωκόμενη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα όλων των δοκιμών σε «SARS-COV-1» σήμαινε κατά κάποιο τρόπο ότι δεν χρειάζονταν απομονώσεις «SARS-COV-2».
Βασίστηκαν σε αναφορές στα μέσα κοινωνικής δικτύωσης και υπέθεσαν από αυτές ότι ένας « κορονοϊός» που σχετίζεται με τον «SARS-COV-1» ήταν ο ένοχος.
Πολλά διαφορετικά γονιδιώματα του «SARS-COV-1» (375) ευθυγραμμίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό των δοκιμών για τον «SARS-COV-2».
Επιλέχθηκαν 3 δοκιμασίες με βάση το πόσο καλά ταίριαζαν με το γονιδίωμα του «SARS-COV-2».
Χρησιμοποίησαν «καθαρισμένο SARS-COV-1» που αναπτύχθηκε σε κύτταρα Vero για να ελέγξουν την αναλυτική ευαισθησία
Υπερφίλτραραν το υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας για να ΜΕΙΩΣΟΥΝ (όχι να εξαλείψουν) τα νουκλεϊκά οξέα υποβάθρου, όπως αυτό του μη συσκευασμένου σε ιό «ιικού» RNA
«Εκλογίκευσαν» (βήχας υπέθεσαν βήχας) ότι το «SARS-COV-1» θα μπορούσε να λειτουργήσει ως θετικός έλεγχος για το «SARS-COV-2» σε όλες τις δοκιμές
Καθόρισαν ότι η δοκιμασία E Gene μπορεί να ανιχνεύσει όλους τους ασιατικούς «ιούς».
Παραδέχονται επίσης ότι ο HCoV-HKU1 δεν είναι καλλιεργήσιμος.
Για κάποιο λόγο, ανακάτεψαν το υπερκείμενο της καλλιέργειας «ιών» με «μη ιογενή» ανθρώπινα δείγματα πτυέλων για τη δοκιμή έναντι της χρήσης μόνο των αναλλοίωτων ανθρώπινων δειγμάτων
Τα αρχικά υποβληθέντα τεχνολογικά προσόντα βασίζονταν σε υλικά κυτταροκαλλιέργειας και συνθετικές κατασκευές
Η ίδια η μελέτη αξιολογήθηκε από ομότιμους και έγινε αποδεκτή σε λιγότερο από 24 ώρες
Για μια σε βάθος ανάλυση αυτής της Απάτης του Drosten PCR, διαβάστε την Έκθεση Επισκόπησης Corman-Drosten:
Αυτός είναι ένας σύντομος κατάλογος των όσων αποκαλύφθηκαν:
«Τον Νοέμβριο του 2020, 22 διεθνούς φήμης επιστήμονες διεξήγαγαν εξωτερική αξιολόγηση της εργασίας του Corman από ομοτίμους για να αξιολογήσουν ανεξάρτητα την ποιότητα και την ακρίβειά της. Στη δημοσίευση αυτή, οι Borger, et al. [6] κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το άρθρο που δημοσιεύθηκε χωρίς εγγυήσεις στο Eurosurveillance περιέχει εννέα σοβαρά επιστημονικά λάθη και τρεις μικρές ανακρίβειες.
Η λεπτομερής εξήγηση αυτών των επιστημονικών σφαλμάτων υπερβαίνει την αρμοδιότητα του παρόντος άρθρου, γι' αυτό και παρατίθενται μόνο παρακάτω.
Εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις εκκινητών, DNA πολυμεράσης και θειικού μαγνησίου. Αυτό οδηγεί σε αύξηση της μη ειδικής πρόσδεσης, της ενίσχυσης και της έλλειψης ειδικότητας για την ταυτοποίηση του ιού SARS-CoV-2.
Μη ειδικοί εκκινητές (ταλαντευόμενα γράμματα) που θα μπορούσαν να προκαλέσουν διάφορες αλληλουχίες εμπρόσθιων εκκινητών και άλλες τόσες αντίστροφες που δεν σχετίζονται καθόλου με τον ιό SARS-CoV-2, με αποτέλεσμα η εξέταση να μην αποτελεί ειδικό εργαλείο για τη διάγνωσή του.
Το τεστ δεν μπορεί να διακρίνει μεταξύ του πλήρους ιού (μολυσματικού) και των ιικών θραυσμάτων.
Διαφορά 10 °C σε σχέση με τη θερμοκρασία ανόπτησης του πρώτου ζεύγους εκκινητών RdRp (άμεσου και αντίστροφου), ενώ θα έπρεπε να είναι 2 °C.
Τα γονίδια που επιλέχθηκαν ήταν λανθασμένα διότι:
⃝ Δεν αντιπροσώπευαν ολόκληρο το μήκος του ιού.
⃝ Το γονίδιο Ε είναι μη ειδικό και υπάρχει σε όλους τους κορονοϊούς.
⃝ Το γονίδιο Ν που εξασφάλιζε τουλάχιστον ότι επρόκειτο για SARS-1 ή SARs-CoV2 αφαιρέθηκε από τον ΠΟΥ από το πρωτόκολλο λόγω έλλειψης ευαισθησίας.
Το γονίδιο RdPd που προτάθηκε από τους Corman, et al. [4] περιέχει πάρα πολλά ταλαντευόμενα γράμματα, ώστε να μπορούν να συντεθούν 2 εμπρόσθιοι εκκινητές, 4 διαφορετικοί αντίστροφοι εκκινητές και 8 διαφορετικοί ανιχνευτές, γεγονός που παρέχει υπερβολική μεταβλητότητα από την άποψη των εμπορικών δοκιμών για τη διασφάλιση της ειδικότητάς του.
Τα προϊόντα PCR δεν έχουν επικυρωθεί σε μοριακό επίπεδο.
Η δοκιμασία PCR δεν περιέχει ένα μόνο θετικό έλεγχο για την αξιολόγηση της ειδικότητάς της για τον SARS-CoV-2 ή έναν αρνητικό έλεγχο για τον αποκλεισμό της παρουσίας άλλων κοροναϊών, γεγονός που καθιστά τη δοκιμασία ακατάλληλη ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για την ταυτοποίηση του SARS-CoV-2. Ιός
Δεν προσδιορίζεται ο αριθμός των κύκλων για να είναι θετική η εξέταση. Αργότερα, ο ΠΟΥ συνέστησε μεταξύ 40 και 45 κύκλων, κάτι που είναι εντελώς λανθασμένο από επιστημονική άποψη».
Και σε περίπτωση που νομίζατε ότι το CDC ήταν υπεράνω της δημιουργίας ενός τεστ PCR χωρίς να υπάρχει διαθέσιμος «ιός», να ξέρετε ότι θα κάνετε λάθος.
Αυτό είναι από την άδεια επείγουσας χρήσης του FDA για το τεστ PCR του CDC που χρησιμοποιείται στις ΗΠΑ:
«Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν επί του παρόντος ποσοτικοποιημένα απομονωμένα στελέχη του ιού του 2019-nCoV, οι δοκιμασίες που έχουν σχεδιαστεί για την ανίχνευση του RNA του 2019-nCoV δοκιμάστηκαν με χαρακτηρισμένα αποθέματα in vitro μεταγραφέντος RNA πλήρους μήκους (γονίδιο N- GenBank accession: MN908947.2) γνωστού τίτλου (αντίγραφα RNA/μl), τα οποία προστέθηκαν σε αραιωτικό που αποτελείται από εναιώρημα ανθρώπινων κυττάρων A549 και μέσο μεταφοράς ιού (VTM) για να μιμηθούν το κλινικό δείγμα.»
https://www.fda.gov/media/134922/download
Είναι να απορεί κανείς γιατί τόσο οι δοκιμές PCR του Drosten όσο και του CDC είχαν τρομερές επιδόσεις όσον αφορά τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα;
«Οι δοκιμασίες E Charité και N2 US CDC ήταν θετικές για όλα τα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων των αρνητικών δειγμάτων και των αρνητικών ελέγχων (νερό). Αυτά τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα διερευνήθηκαν (λεπτομέρειες παρακάτω), αλλά η ευαισθησία αυτών των δοκιμασιών δεν αξιολογήθηκε περαιτέρω.»
«Αξίζει να σημειωθεί ότι η δοκιμασία Charité ήταν η πρώτη που δημοσιεύθηκε στο αρχικό στάδιο της πανδημίας [9] και χρησιμοποιήθηκε ευρέως παγκοσμίως [8].»
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7355678/
Φαίνεται λοιπόν ότι δεν υπάρχει πλέον ανάγκη να υπάρχουν διαθέσιμοι «ιοί» για τη δημιουργία και επικύρωση των δοκιμών/τεστ. Ο Drosten και άλλοι μπορούν να μπουν στο Twitter, να διαβάσουν κάποιες αναφορές στα μέσα κοινωνικής δικτύωσης και στη συνέχεια να καταλήξουν σε ένα τεστ για έναν «νέο ιό» στους υπολογιστές τους, χωρίς ποτέ να χρειάζονται τον πραγματικό «ιό» παρόντα. Μπορούν απλά να χρησιμοποιήσουν τους παλιούς «ιούς», που δεν σχετίζονται τόσο στενά όσο θέλουν να πιστεύετε, ως υποκατάστατο. Αρκετά ωραίο κόλπο με το πώς όλα, από τον ίδιο τον «νέο ιό» μέχρι το τεστ για την ανίχνευσή του, είναι όλα βασισμένα στον υπολογιστή. Αυτοί οι ιολόγοι σίγουρα απέφυγαν μια σφαίρα με τα μοριακά τους κόλπα και τους αλγόριθμους υπολογιστών συναίνεσης, καθώς δεν υπάρχει ανάγκη για το χρυσό πρότυπο ενός καθαρισμένου/απομονωμένου «ιού». Οι συνθετικές δημιουργίες που βασίζονται σε υπολογιστές και βασίζονται στα μέσα κοινωνικής δικτύωσης είναι όλη η μόδα αυτές τις μέρες.
Παρακαλώ βοηθήστε να στηρίξετε το έργο μου. 🙏
----Δικτυογραφία :
Drosten “SARS-COV-2” PCR Paper – ViroLIEgy
https://viroliegy.com/2021/09/18/drosten-sars-cov-2-pcr-paper/